云南省1株基孔肯雅毒株全基因组序列测定及特征分析

陈瑶瑶,赵晓南，孙艳红，张美玲，周洁楠

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)是披膜病毒科甲病毒属的单股正链RNA病毒，主要通过白纹伊蚊和埃及伊蚊叮咬传播[1]。1952年，在坦桑尼亚首次检测到CHIKV[2]，随后在乌干达和许多其他撒哈拉以南非洲国家均发现了CHIKV，在过去的5年里，更是以惊人的速度扩散到亚洲、非洲、欧洲和美洲的100多个国家，成为日益严重的全球健康威胁[3]。1986年云南省从蝙蝠脑组织中分离出一株CHIKV毒株[4]，这是我国首次分离得到CHIKV毒株，2008年在广东出现了首例输入性基孔肯雅热病例[5]，随后在我国的其他地方不断出现输入性病例和本地疫情[6-8]。云南省位于中国西南边陲，与多个东南亚国家接壤，经济贸易往来及国际间旅行日益频繁, 存在极大输入性风险，再加上丰富多样的气候类型，适合伊蚊生存繁殖的自然地理环境[9]，云南省基孔肯雅热流行风险正在加剧。2019年6月，通过流行病学调查及实验室检测，云南省确诊1例基孔肯雅热输入性病例，本研究通过对CHIKV进行分离培养和全基因组测序，分析病毒遗传进化趋势及氨基酸位点变异情况，为云南省防控基孔肯雅热提供科学依据。

1 材料与方法

1.1标本来源 2019年6月27日采集得到1名缅甸仰光飞抵昆明长水机场的旅客血清，送至云南省疾病预防控制中心排查基孔肯雅热。

1.2核酸提取及real-time RT-PCR检测 采用江苏硕世全自动核酸提取仪和病毒核酸提取试剂盒(货号：SDK60104)进行核酸提取，病毒核酸检测使用基孔肯雅病毒检测试剂盒(江苏硕世，货号：JC40104)，具体反应体系和反应条件参照试剂盒说明书。

1.3病毒分离培养 将患者血清接种于80%单层非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)中，置于37 ℃、5% CO2培养箱吸附2 h后，加入含有2%胎牛血清、7.5%碳酸氢钠及双抗的维持液(维持液基质DMEM)，继续放入培养箱进行培养。每日观察病变情况。收获盲传第2代72 h培养物进行后续实验。

1.4测序引物 设计参考相关文献[8]，合成基孔肯雅全基因组扩增引物，对CHIKV进行分段扩增，以便后续测序。引物由昆明擎科生物公司合成。

1.5全基因组测序 使用TAKARA One Step RT-PCR试剂盒(货号：RR057)对病毒核酸进行扩增，反应体系：2×1 step Buffer 12.5 μL，1 step Enzyme mix 1 μL，Forward Primer(10 μmol/L)1.5 μL，Reverse Primer(10 μmol/L)1.5 μL，无酶水6 μL，模板2.5 μL，反应体系总体积25 μL。反应程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，共30个循环，72 ℃再延伸7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用凝胶成像系统观察结果，阳性扩增产物送至昆明擎科生物公司进行测序。

1.6序列拼接和系统进化发生树构建及分析 使用DNAStar 7.1软件对测序结果进行拼接，在NCBI上下载参考株序列，通过Mega5.0软件对序列进行比对和系统发生树构建。采用Neighbor-joining法构建进化树，bootstrap值设置为1 000。

2 结 果

2.1流行病学调查 患者赵某，男，43岁，云南人。在缅甸经商，经常往返于昆明-仰光。患者于2019年1月前往仰光，2019年6月26日返回昆明，期间当地有蚊传疾病散发，自述有蚊虫叮咬史。

2.2Real-time RT-PCR检测 病例血清标本核酸检测显示CHIKV阳性，Ct值为15.73。

2.3病毒分离鉴定 将1代细胞培养物接种细胞后，观察细胞病变情况，细胞逐渐融合、堆聚，在72 h后病变达到80%，将细胞板置于-70 ℃冰箱。反复冻融2次，取200 μL融解后的培养物进行核酸提取及病毒核酸检测。Real-time RT-PCR结果显示CHIKV阳性，Ct值为9.14。见图1。

图1 CHIKV感染Vero细胞病变情况Fig.1 Cytopathogenic effects after Vero cells infection with CHIKV

2.4全基因组测序 对测序数据进行拼接处理后获得CHIKV全基因组序列，命名为YN0627，全长为11 586 nt，其基因结构符合CHIKV的基因特征，基因组内包含两个完整的编码框，分别编码4个非结构蛋白(nsP1-nsP2-nsP3-nsP4)和5个结构蛋白(C-E3-E2-6K-E1)，两个编码框之间有一个非编码的连接区，长度为65个核苷酸。非结构蛋白编码区共包含7 425个核苷酸，编码2 474个氨基酸；结构蛋白编码区共包含3 747个核苷酸，编码1 248个氨基酸，均不存在碱基的插入和缺失。5′端起始的76个核苷酸和3′端273个核苷酸为非编码区。

2.5全基因组进化分析 通过对YN0627的全基因组以及编码区进行BLAST N检索，得到序列相似度最高的均为CHIKV。将YN0627的基因组编码区与选取的参考序列进行多重比对，系统进化分析显示YN0627与来自泰国的MN630017、MK468801、来自中国的MH400249、来自孟加拉的MF773566等毒株关系密切，并与东中南非洲遗传谱系(East, Central and South African Lineage, ECSA)的其他流行株聚集在一起，显示出紧密的进化相关性，见图2。与ECSA谱系内的参考序列进行多重比对，YN0627的编码区与参考序列相比，核苷酸同源性为85.24%～99.96%，氨基酸同源性为95.34%～99.97%；与非洲原型株S27比较，核苷酸同源性为97.33%，氨基酸同源性为98.53%。

图2 CHIKV-YN0627系统进化树Fig.2 Phylogeny of CHIKV-YN0627

2.6基因位点分析 在YN0627的 5个结构蛋白的编码区域中，一共观察到28个氨基酸变异位点。未观察到E1中的对白纹伊蚊的适应性突变A226V，但是有E1：D284E、E1：K211E、E2：V264A和E2：I211T突变，其他一些位点，例如可能影响氨基酸pH值的E2：K252Q[5]没有被观察到；E2蛋白上两个重要糖基化抗原位点263N和345N呈高度保守[10]，见表1。

3 讨 论

系统进化分析通过不同的地理位置将CHIKV分为3个遗传谱系：东中南非洲(ESCA)谱系、亚洲(Asian)谱系和西非(West Africa)谱系。从本研究的系统进化分析结果来看，YN0627与东南亚各国毒株关系密切，属于ESCA遗传谱系，与流行病学调查资料结果相一致，是来自东南亚国家缅甸的输入性病例。中国分离得到大部分基孔肯雅毒株都属于输入型的，因此国内各毒株间进化关系并不是特别密切，但是我们依旧需要对该病毒进行密切关注和更加深入的研究，特别应该关注能够增强病毒毒力和适应性突变的位点。

表1 CHIKV YN0627结构蛋白氨基酸变异位点分析Tab.1 Amino acid variation sites in the structural protein of CHIKV-YN0627

CHIKV共编码4个非结构蛋白和5个结构蛋白，非结构蛋白不会包装到最终病毒体中，结构蛋白才是宿主体液免疫应答和大多数疫苗的关键靶点[11]，因此本研究着重对结构蛋白的氨基酸变异位点进行分析。分析结果发现YN0627没有E1：A226V的突变，而观察到了E1：K211E、E1：D284E、E2：V264A和E2：I211T突变。E1：A226V突变在2005年首次被发现，该位点的突变能够提高CHIKV在白纹伊蚊中的适应性[12]，在东南亚白纹伊蚊为优势种群的多个地区，都分离到了有E1：A226V突变的CHIKV毒株[13]。但是有研究证明，在E1：226A的基础上引入E1：K211E和E2：V264A的突变，能使CHIKV在感染埃及伊蚊14天后，其体内的滴度成倍数增长：在中肠中增加13倍，在腿和翅膀中增加15倍，在唾液中增加62倍[14]。有学者在云南省边境地州开展蚊媒媒介的相关监测和研究，结果表明，白纹伊蚊在云南省内分布广泛，但是近年来埃及伊蚊的分布区域呈现出逐渐扩大的趋势，埃及伊蚊孳生优势较白纹伊蚊明显，有取代白纹伊蚊成为优势种及不断向周边区域扩散和定殖的分布趋势[15-16]，综合分离株YN0627中存在E1：226A的基础上的E1：K211E和E2：V264A，文献实验数据显示这些突变能够提高CHIKV对埃及伊蚊的适应性，提示云南省应当加强对CHIKV的监测和研究。

在YN0627中还观察到了E1：D284E和E2：I211T突变，E1：D284E对膜融合和病毒体的装配有很重要的作用[12]。另有研究发现，E2：I211T突变在最近发现的ESCA谱系中普遍存在，这表明E2：I211T的突变对于CHIKV适应ECSA流行区域普遍存在的某些特定条件非常重要[17]。我们还观察到了结构蛋白上的其他变异如C：P23S，C：V27I，E3：I23T，6K：V8I，E1：M269V等等，但是这些位点对病毒功能的影响尚不清楚。

基于我国的基孔肯雅热疫情一直以输入性的散发病例为主，国内人群缺乏免疫力，普遍易感，且目前尚无有效的疫苗和抗病毒药物，做好对CHIKV感染源头的防控，即防蚊灭蚊工作至关重要。还需加强重点人群宣教，到高风险地区旅居的人应采取基本的防蚊措施，返回时如感不适，就医时应主动提供自身旅居史。同时需加强医务人员培训，提高医务人员对疾病的识别能力和对传染病的敏感性，防止本地病例的产生。

利益冲突：无