寒痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠Wnt/β-catenin和BMP/Smad信号通路的影响

庞学丰 李玉玲 吴燕红 冯玉青 刘欢 蒙宇华 黄政治 林菊 吴伟泳 马静 廖家瑜 王思思

【摘 要】目的：观察寒痹康汤对胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）和骨形态发生蛋白/Smad（BMP/Smad）信号通路的影响。方法：采用牛Ⅱ型胶原蛋白和弗氏不完全佐剂充分混合乳化制成CⅡ乳剂，进行皮下注射成功造模CIA大鼠模型，予灌服甲氨蝶呤作为对照，观察寒痹康汤高、中、低剂量提取物对CIA大鼠关节肿胀指数，以及Wnt/β-catenin和BMP/Smad信号通路相关蛋白表达的影响。结果：治疗4周后，各治疗组大鼠关节肿胀指数与模型对照组比较，差异有统计学意义

（P < 0.01）。寒痹康汤高剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）;寒痹康汤中、低剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。与空白对照组比较，模型对照组Wnt5α、Wnt7α蛋白表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05）;与模型对照组比较，甲氨蝶呤组和寒痹康汤高、中、低剂量组Wnt5α、Wnt7α蛋白表达降低，差异有统计学意义（P < 0.01）;寒痹康汤高、中剂量组与甲氨蝶呤组Wnt5α、Wnt7α蛋白表达比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。与空白对照组比较，模型对照组β-catenin、BMP-2、BMP-4、BMP-5、Smad4、Smad5、Smad7蛋白表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。

与模型对照组比较，甲氨蝶呤组和寒痹康汤高、中、低剂量组上述蛋白表达降低，差异有统计学意义（P < 0.05）;寒痹康汤高、中剂量组与甲氨蝶呤组上述蛋白表达比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：寒痹康汤可以通过调节Wnt/β-catenin和BMP/Smad信号通路达到治疗类风湿关节炎及抗骨侵蚀的作用。

【关键词】 胶原诱导性关节炎;类风湿关节炎;寒痹康汤;Wnt/β-连环蛋白;骨形态发生蛋白/Smad;信号通路;大鼠

Effect of Hanbikang Tang（寒痹康汤）on Wnt/β-catenin and BMP/Smad Signaling Pathway in Collagen Induced Arthritis Rats

PANG Xue-feng，LI Yu-ling，WU Yan-hong，FENG Yu-qing，LIU Huan，MENG Yu-hua，HUANG Zheng-zhi，LIN Ju，

WU Wei-yong，MA Jing，LIAO Jia-yu，WANG Si-si

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Hanbikang Tang（寒痹康湯）on Wnt/β-catenin and BMP/Smad signaling pathway in collagen induced arthritis（CIA）rats.Methods：CⅡ emulsion was prepared by mixing bovine type Ⅱ collagen and Freund's incomplete adjuvant.The CIA rat model was successfully established by subcutaneous injection，and methotrexate was given to establish the control.The effects of high，medium and low dose extracts of Hanbikang Tang on joint swelling index and expressions of Wnt/β-catenin and BMP/Smad signaling pathway related proteins in CIA rats were observed.

Results：After 4 weeks treatment，the difference of the joint swelling index between each treatment group and the model control group

was statistically significant（P < 0.01），

among which the difference between the high-dose Hanbikang Tang group and the methotrexate group was statistically significant（P < 0.01），and the difference between the middle and low dose Hanbikang Tang group and the methotrexate group was not statistically significant（P > 0.05）.Compared with the blank control group，the protein expression of wnt5α and wnt7α in the model control group increased，and the difference was statistically significant（P < 0.05）;compared with the model control group，the protein expression of wnt5α and wnt7α in the methotrexate group，the high，medium and low dose Hanbikang Tang groups decreased，and the difference was statistically significant（P < 0.05）.There was no significant difference in the protein expression of wnt5α and wnt7α between the high and medium dose Hanbikang Tang groups and the methotrexate group（P > 0.05）.Compared with the blank control group，the protein expressions of β-catenin，BMP-2，BMP-4，

BMP-5，Smad4，Smad5 and Smad7 in the model control group was increased，and the difference was statistically significant（P < 0.05）;compared with the model control group，the above protein expressions of the methotrexate group and the high，medium and low dose Hanbikang Tang groups were decreased，and the difference was statistically significant（P < 0.05）.There was no significant difference in the above protein expressions between the high and medium dose Hanbikang Tang groups and methotrexate group（P > 0.05）.Conclusion：

Hanbikang Tang can treat rheumatoid arthritis and resist bone erosion by regulating Wnt/β-catenin and BMP/Smad

signaling pathways.

【Keywords】 collagen induced arthritis;rheumatoid arthritis;Hanbikang Tang（寒痹康汤）;Wnt/β-catenin;

BMP/Smad;signal pathway;rats

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种

常见的难以治愈的慢性自身免疫性疾病，主要侵犯外周关节，未经系统治疗的晚期RA患者将会出现关节结构的破坏和关节畸形改变，导致功能丧失[1]。

研究资料表明，Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）和骨形态发生蛋白/Smad（BMP/Smad）信號通路在RA的发生、发展以及骨质破坏中起着非常重要的作用，值得深入探讨和研究。本实验充分混合牛CⅡ胶原蛋白和弗氏不完全佐剂，制成CⅡ乳剂，进行皮下注射成功建立胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型，予灌服甲氨蝶呤作为对照，观察不同剂量的寒痹康汤提取物对Wnt/β-catenin和BMP/Smad信号通路的影响情况。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级Wistar雌性大鼠60只，购自广西医科大学实验动物中心（动物许可证号SCXK桂2014-0002），体质量（100±10）g。

1.2 实验试剂 Wnt5α（生产批号PA5-80231）、β-catenin（生产批号71-2700）、BMP-2（生产批号PA5-85956）、BMP-4（生产批号PA5-102424）、Smad4（生产批号PA5-34806）、Smad5（生产批号39-5700）检测试剂盒购自Invitrogen公司;Wnt7α（生产批号10605-1-AP）、Smad7（生产批号25840-1-AP）、GAPDH（生产批号60004-1-Ig）检测试剂盒购自Proteintech公司;BMP-5（生产批号sc-517459）检测试剂盒购自Santa Cruz Biotechnology公司;造模所用的弗氏不完全佐剂和牛Ⅱ型胶原蛋白购自Chondrex公司;全蛋白提取试剂盒（生产批号BC3710）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（生产批号P0010S）购自碧云天生物技术公司。

1.3 实验药物 甲氨蝶呤片（国药准字H22022674）

购自通化茂祥制药有限公司;寒痹康汤提取物由广西中医药大学附属瑞康医院新药研发中心按照标准进行提取制备提供，将寒痹康汤（秦艽15 g、黄芪15 g、青风藤15 g、防风10 g、熟附子10 g、麻黄10 g、当归10 g、淫羊藿20 g、狗脊20 g）经乙醇萃取，50 ℃溶解离心，取上清液得到含有活性部位的浸膏。于当日进行动物实验之前，按照本实验的要求，按比例加入乙醇和生理盐水进行溶解配制备用。

2 方 法

2.1 分组及造模 将60只清洁级Wistar雌性大鼠放入动物实验中心的饲养笼进行适应性喂养，7 d后随机选取10只作为空白对照组，剩余50只按照有关造模标准[2]注射CⅡ乳剂进行造模：于无菌条件下，将5 mL牛Ⅱ型胶原蛋白与5 mL弗氏不完全佐剂一起放入三通管中，进行充分混合乳化制成CⅡ乳剂，制备完成放置于4 ℃冰箱中保存备用。分别在大鼠的颈部和背部给予皮内注射CⅡ乳剂造模，每个部位注射0.1 mL。于14 d后再次按照此前的注射方法和剂量进行注射。根据上述文献造模成功的标准进行判断：大鼠四肢的足爪已经出现严重肿胀，并且踝关节直径增长幅度≥2 mm，评为4分。确定每只大鼠均造模成功，符合实验要求后，再按照随机原则分为模型对照组、寒痹康汤高剂量组、寒痹康汤中剂量组、寒痹康汤低剂量组、甲氨蝶呤组，每组10只。

2.2 治疗给药 不限制空白对照组大鼠的休息、活动及饮食;模型对照组大鼠予2 mL·（100 g）-1的生理盐水进行灌胃，每日1次;甲氨蝶呤组大鼠每周灌服1次2.7 mg·kg-1的甲氨蝶呤药液，寒痹康汤高、中、低剂量组大鼠分别予高、中、低剂量寒痹康汤提取物[31.25 g·（100 g）-1·d-1、15 g·（100 g）-1·d-1、7.5 g·（100 g）-1·d-1]进行灌胃（药物剂量参考有关文献计算[3]，即按70 kg人体质量与200 g大鼠的换算系数计算得出），每日2次（每日8：00，18：00）。

2.3 关节肿胀程度评分 按照参考文献[4]中的标准进行评分：0分，无关节肿胀;1分，小趾关节出现轻度肿胀;2分，小趾关节和足跖均出现肿胀;3分，踝关节以下的足爪均出现肿胀;4分，包括踝关节在内的所有关节均出现肿胀。观察并记录所有大鼠治疗前及治疗1，2，4周的关节肿胀变化情况。

2.4 Wnt/β-catenin和BMP/Smad信号通路相关蛋白表达的检测 除空白对照组外，其余各组均给药治疗28 d，之后所有大鼠以水合氯醛进行腹腔注射充分麻醉后以颈椎脱臼法处死;逐层分离膝关节各层组织，打开关节腔，可见由髌骨下极向下延续有一层浅淡黄色平滑光亮的滑膜组织;用手术刀片小心切下，再用眼科直镊进行钝性分离并完整剥离滑膜组织，置于-80 ℃冰箱冰冻保存。本实验大鼠的各种处理符合实验动物伦理学要求。

检测各项指标时按以下步骤进行：滑膜组织称重后置液氮中研磨，将粉末移至玻璃匀浆器中，按1 mL·（0.1 g）-1加入冰预冷的组织总蛋白裂解缓冲液。冰上匀浆10～15 min，移匀浆至离心管，4 ℃，离心机以10 000 r·min-1离心15 min，离心半径40 cm，取上清至新的离心管即为总蛋白，取10 μL放入EP管备蛋白含量测定，其余置-80 ℃冰箱冻存备用。总蛋白含量测定采用Bradford法，以保证各组样品上样量相同。待测蛋白变性（100 ℃，5 min）后，行SDS-PAGE分离，然后电转移至PVDF膜，再用质量分数为5%的脱脂奶粉1×TBST缓冲液（20 mmol·L-1 Tris-base，137 mmol·L-1氯化钠，体积分数为0.1%的Tween-20） 孵育1 h，TBST缓冲液漂洗后，PVDF膜在室温下与一抗（Wnt5α、Wnt7α、β-catenin、BMP-2、BMP-4、BMP-5、Smad4、Smad5、Smad7和GAPDH） 4℃孵育过夜，再与免疫球蛋白G二抗室温下孵育1 h，每次孵育之前均用TBST缓冲液漂洗3次，每次5 min。然后再与化学发光剂ECL A液和B液1 mL混合反应1 min，ChemiDoc? MP Imaging System图像工作站取像，测定并分析条带吸光度，以GAPDH为内参。

2.5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用方差分析或t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠治疗前后关节肿胀情况比较 治疗2周后，各治疗组大鼠关节肿胀指数均低于模型对照组，其中寒痹康汤高、中剂量组和甲氨蝶呤组与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）;

寒痹康汤低剂量组与模型对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。治疗4周后，各治疗组大鼠关节肿胀指数与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）;寒痹康汤高剂量组关节肿胀指数优于甲氨蝶呤组（P < 0.01）;寒痹康汤中、低剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

3.2 各组大鼠Wnt5α、Wnt7α蛋白表达比较 与空白对照组比较，模型对照组Wnt5α、Wnt7α蛋白表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型对照组比较，甲氨蝶呤组和寒痹康汤高、中、低剂量组Wnt5α、Wnt7α蛋白表达降低，差异有统计学意义（P < 0.01）。寒痹康汤高、中剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

3.3 各组大鼠β-catenin、BMP-2蛋白表达比较 与空白对照组比较，模型对照组β-catenin、BMP-2蛋白表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型对照组比较，甲氨蝶呤组和寒痹康汤高、中、低剂量组β-catenin、BMP-2蛋白表达降低，差异有统计学意义（P < 0.01）。寒痹康汤高、中、低剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

3.4 各组大鼠BMP-4、BMP-5蛋白表达比较 与空白对照组比较，模型对照组BMP-4、BMP-5蛋白表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型对照组比较，甲氨蝶呤组和寒痹康汤高、中、低剂量组BMP-4、BMP-5蛋白表达降低，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。寒痹康湯高、中、低剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表4。

3.5 各组大鼠Smad4、Smad5、Smad7蛋白表达情况比较 与空白对照组比较，模型对照组Smad4、Smad5、Smad7蛋白表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型对照组比较，甲氨蝶呤组和寒痹康汤高、中、低剂量组Smad4、Smad5、Smad7蛋白表达降低，差异有统计学意义

（P < 0.05）。寒痹康汤高、中剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表5。

4 讨 论

Wnt/β-catenin和BMP/Smad信号通路作为一种快速信号转导途径，参与介导机体各种生理病理反应，是机体的一种重要调节机制。并且最近几年关于Wnt/β-catenin和BMP/Smad信号通路的研究证明，该信号通路在RA发病中有重要作用。

研究表明，Wnt通路在RA发生过程中起重要调控作用[5]，RA发病过程中产生的部分炎症介质和细胞因子[如白细胞介素（IL）-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等]、关节的骨质破坏以及骨修复的缺陷都与Wnt信号转导通路有关，特别是与Wnt/β-catenin途径关系密切，而后者在RA滑膜细胞的生长、发育、增殖、分化中发挥更重要的调控作用[6]。

BMP有BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-9等多个亚型，在骨形成的数个阶段均起作用。哺乳动物的Smad有8种（Smad1～Smad8），其中Smad2～Smad4、Smad7参与转化生长因子-β的信号转导，而Smad1、Smad4～Smad8参与BMP和活化素等的信号转导[7]。对BMP/Smad信号通路的研究结果显示，BMP可以提高成骨细胞中血管内皮生长因子mRNA表达，从而发挥诱导成骨的作用。BMP受体分为Ⅰ型和Ⅱ型2种，BMP与Ⅱ型受体结合并激活该受体后，进一步磷酸化Ⅰ型受体，之后依次激活下游一系列的Smad蛋白[8]，Smad蛋白进入细胞核内与某些成骨相关基因的转录因子相互作用进而调控转录。实验已经证明，在RA的发生和发展过程中，间充质祖细胞样细胞群异常增殖和聚集，从而产生大量的炎性分子，BMP信号通路被过度激活，过量表达的BMP-2能够进一步诱导下游信号分子的活化，最终影响骨和软骨的形成，并导致骨损伤。针对RA患者滑膜组织活检的一项研究结果表明，其BMP-2和BMP-6含量均显著高于正常健康人群，BMP-7能抑制RA患者体内正常的成纤维样滑膜细胞向上皮样间充质干细胞转化[9]。

甲氨蝶呤是临床常用的改善病情抗风湿药，是治疗RA的经典锚定药，疗效确切，常被用作实验研究的对照药物，因此笔者选择其作为本实验的对照药物。

中医学认为，RA属“痹病”范畴，正气亏虚是RA发病的内因，感受风寒湿之邪为外因，治疗原则为扶正祛邪。寒痹康汤为笔者根据20多年治疗寒湿型活动期RA经验所总结出的临床验方，由补肾药和抗风湿药物配伍而成，具有补益肝肾、益气温经、祛风除湿、蠲痹止痛的功效。笔者研究团队多年应用寒痹康汤治疗寒湿型RA患者发现，本方能明显改善患者的临床症状，恢复红细胞沉降率、C反应蛋白、类风湿因子、免疫球蛋白至正常水平，且未见明显的不良反应[10]。动物实验表明，寒痹康汤能降低CIA大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β、核转录因子-κB水平[11-14]。然而，在RA的发病及加重过程中，还有不同的因素参与，值得深入研究。因此，本研究从Wnt/β-catenin和BMP/Smad信号通路着手，以期进一步阐明寒痹康汤治疗RA的作用机制，为临床应用提供研究基础。

本实验结果表明，在CIA大鼠中，Wnt5α、Wnt7α、β-catenin、BMP-2、BMP-4、BMP-5、Smad4、Smad5、Smad7蛋白表达升高，经治疗后均降低，提示寒痹康汤可以通过调节Wnt/β-catenin和BMP/Smad信号通路而达到治疗RA的作用，能延缓关节骨质破坏，是其治疗RA及抗骨侵蚀的作用机制之一。

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收稿日期：2020-12-16;修回日期：2021-01-15