华南虎母乳成分分析及虎代乳粉的研制

许卫华 林开雄 林炜明* 陈腾腾 刘 丹 傅文源,4*

(1.龙岩学院生命科学学院，龙岩364000；2.福建梅花山华南虎繁育研究所，上杭364201；3.黑龙江东北虎林园，哈尔滨150027；4.龙岩市地质公园保护发展中心，龙岩364000 )

我国是全球虎的发源地，也是世界虎亚种分布最多的国家[1]。作为全球生物多样性保护的旗舰物种，虎种群的有效保护和可持续生存对中国乃至全球生态安全具有深远意义，是实现“生态文明建设”的重要组成部分。

我国现有4个虎亚种(印支虎、孟加拉虎、华南虎和东北虎)，其中，华南虎是我国特有的虎亚种，亦称中国虎，被认为是所有虎的祖先，也是最为濒危的虎亚种。目前存在于中国动物园中的人工种群是拯救华南虎的唯一基础。由于近交衰退、雌虎母性不强、带仔能力差甚至产后或哺乳期遗弃幼崽等原因，幼虎死亡率普遍较高，其中华南虎幼虎在3个月内死亡率高达46%[2]，因此，人工育幼是包括华南虎在内的所有虎亚种保存的重要手段之一。

对幼虎进行人工哺育是提高种群繁殖率、扩大种群数量的重要手段。国内外众多虎饲养单位经过多年摸索，已经建立了人工育幼的基本方法，然而没有虎专用的代乳粉，大多是用犬猫宠物配方奶粉或婴儿奶粉[3-5]，究其原因是缺乏对虎母乳营养成分的了解。为此，本研究收集了产后6～10 d华南虎母乳，对乳中氨基酸、脂肪酸、乳糖、常量矿物元素和微量矿物元素等营养成分含量进行了详细的检测和分析，并根据结果开发了虎专用代乳粉，在18只东北虎幼虎和1只华南虎幼虎人工育幼工作中取得了成功，为我国虎人工育幼和虎种群的有效保护提供了理论和实践参考。

1 材料与方法

1.1 母虎乳样的采集与测定

母虎乳样采集对象：3只饲养于福建梅花山华南虎繁育研究所(福建省龙岩市上杭县)的健康成年华南虎母虎，母虎胎次分别为第3胎、第4胎和第5胎，分别于产后第6、7和9天麻醉挤奶。

母虎的麻醉及乳样采集：首先麻醉保定，按照每100千克体重300 mg盐酸赛拉嗪(100 mg/mL)和200 mg盐酸氯胺酮剂量配制麻醉药液，吹管肌肉注射。保定好后，剃除乳房周边的被毛，清洁乳房，用热毛巾按摩乳房2～3 min，徒手挤压乳房，若挤不出乳，再次用热毛巾按摩乳房直至挤奶成功。挤完乳后，按照每100 kg体重120 mg盐酸苯噁唑(30 mg/mL)剂量肌肉注射以加速苏醒。每只母虎收集30～40 mL母乳，收集在50 mL DNase/RNase-Free离心管。采集到的母乳先4 ℃降温30 min，再于-20 ℃冷冻保存备用，冷冻储存条件下1 d之内送至通标标准技术服务有限公司厦门分公司进行测定。

测定指标及方法：测定乳中氨基酸、脂肪酸、乳糖、常量和微量矿物质元素等营养成分含量，其中氨基酸(除色氨酸外)含量采用GB 5009.124—2016方法检测，色氨酸含量采用碱水解的方法，用氨基酸分析仪(日立L-8900全自动氨基酸分析仪)检测；脂肪酸含量采用AOAC(2008)996.06方法检测；乳糖含量采用GB 5009.8—2016方法检测；钙、磷、钠、镁、钾、铁、锌和锰含量采用GB 5009.268—2016方法检测，铬、钴、铜、硒、钼含量采用GB 5009.268—2016方法检测。

1.2 幼虎人工代乳粉的配制

虎代乳粉是按照人工采集母虎乳营养成分测定结果(尤其是氨基酸)研制而成的。因采集的虎母乳含量有限，只能优先检测氨基酸、脂肪酸、乳糖、矿物元素等含量，本研究未能检测虎母乳中维生素含量，代乳粉中(风干基础)维生素含量是根据NRC(2006)[6]中猫推荐饲粮中(风干基础)相应值乘以1.5倍的安全系数进行配制。虎代乳粉组成及营养水平见表1。

1.3 幼虎的人工育幼试验

1.3.1 幼虎来源

福建梅花山华南虎繁育研究所(福建省龙岩市上杭县)华南虎幼虎1只；东北虎林园(黑龙江省哈尔滨市)东北虎幼虎18只；19只幼虎从第1天开始完全采用人工配制的代乳粉进行饲喂直至断奶。

表1 虎代乳粉组成及营养水平(风干基础)

1.3.2 代乳粉的饲喂方案

根据虎人工育幼饲养管理要求，奶水温度控制在38 ℃左右(奶水滴至手腕有轻微热感即可)，喂奶前后用温湿毛巾模仿母虎对幼虎进行护理，梳理幼虎皮毛。30日龄前每天给幼虎刺激排便1～2次，30日龄后，一般不主动刺激排便，如连续2～4 d不排便，需进行辅助刺激排便，逐步让幼虎自主排便。代乳粉饲喂方法见表2。

表2 虎代乳粉饲喂方法

1.3.3 仔虎处置

仔虎取出后应进行如下处理：1)检查体表，处理伤口，判定雌雄；2)恢复体温，干毛巾擦拭或吹风机吹干被毛后放置育婴箱；3)处理脐带，检查脐带是否感染，将脐带扎好并用碘酒进行消毒；4)听诊心肺、称量体重、测体温。

1.3.4 人工育幼环境设置

27日龄以内，冬季环境下，幼虎使用育婴箱来维持恒定育幼环境，1日龄时温度为30 ℃，之后每天下降0.2 ℃，最后保持在25 ℃；夏季根据实际适当缩短使用育婴箱的天数，同时，起始温度降至28 ℃。28～34日龄，白天将虎转移至育婴室木板隔栏活动，夜间在育婴箱内，木板隔栏长2 100 mm×宽900 mm×高1 100 mm，活动面积约为1.89 m2，并用木板拼接作隔板；隔栏底面距地面300 mm，用角钢和钢网做支撑，上面用木板拼接铺设，这样便于清扫，同时可从底部对隔栏进行环境加温取暖；育婴室上方为敞开式，可与外室形成空气对流，保持育婴室内通风换气。35～60日龄，完全在育幼室隔栏活动，在温度较低时利用暖风机进行环境温度辅助，维持在25 ℃左右。在气温允许条件下，60日龄后，根据实际情况适时将幼虎移出育婴室，转为虎舍笼养环境。

1.4 数据统计分析

数据基本处理用Excel 2010进行，采用卡方检验(χ2test)检测不同组间计数型数据(百分比)的显著性，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 华南虎母乳成分检测结果

对产后第6、7和9天的3只华南虎进行麻醉挤奶,分别对3份虎母乳样品中氨基酸、脂肪酸、乳糖、常量矿物元素和微量矿物元素含量和组成进行了检测，结果见表3至表6。

由表3、表4和表6可以看出，华南虎母乳中总氨基酸、总脂肪酸、乳糖含量分别为(10.85±0.80)%、(8.94±1.14)%和(2.70±0.14)%，以绝干基础计算，总氨基酸和总脂肪酸含量之和为85.86%，为母乳中最主要的两大营养物质，乳糖为母乳中第三大营养物质，含量为11.71%。

由表3可以看出，母乳中油酸、亚油酸和棕榈酸含量分别为41.13%、21.03%和20.88%，为含量最高的3类脂肪酸；饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量分别为26.137%、48.434%和25.168%；多不饱和脂肪酸中，亚油酸和亚麻酸含量分别为21.029%和1.230%，为最主要的ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸脂肪酸，ω-6脂肪酸多不饱和/ω-3多不饱和脂肪酸为15.36∶1.00。

由表5可以看出，新鲜母乳中钙、磷、钠和钾含量分别为0.156%、0.179%、0.117%和0.088%，为含量最高的4个矿物质元素，钙/磷为1.00∶1.15。

表3 华南虎新鲜母乳中氨基酸组成

表4 华南虎新鲜母乳中脂肪酸组成

续表4项目Items 脂肪酸含量Fatty acid content占总脂肪酸比例Proportion of total fatty acids二十二碳六烯酸 C22∶6 cis-4,7,10,13,16,19 0.010±0.0000.112总脂肪酸 Total fatty acids8.940±1.144 饱和脂肪酸 SFAs2.337±0.22026.137单不饱和脂肪酸 MUFAs4.330±0.57548.434多不饱和脂肪酸 PUFAs2.250±0.33825.168ω-6多不饱和脂肪酸 ω-6PUFAs2.113±0.32623.639ω-3多不饱和脂肪酸 ω-3PUFAs0.137±0.0211.529ω-6多不饱和脂肪酸/ω-3多不饱和脂肪酸 ω-6PUFA/ω-3PUFA15.46∶1.00

表5 华南虎新鲜母乳中常量和微量矿物元素组成

表6 华南虎母乳营养成分分析

2.2 幼虎代乳粉的配制

首先确定幼龄虎代乳粉应以乳蛋白为主，乳蛋白原料包括：牛全乳粉(全乳蛋白)、牛乳清浓缩蛋白(乳清蛋白)和牛乳酪蛋白3种最主要的乳蛋白来源。将虎全乳蛋白(3份母乳平均值)和上述3个乳蛋白以及大豆蛋白的氨基酸进行比对，乳蛋白原料和大豆蛋白氨基酸数据摘自NRC(2012)[7]动物营养数据库。

A：虎母乳、3种牛乳蛋白原料和大豆蛋白氨基酸谱对比；B：不添加任何晶体氨基酸条件下，代乳粉和虎母乳氨基酸谱比对；C：补充4种缺乏氨基酸后，代乳粉和虎母乳氨基酸谱比对。

从图1可以看出，在乳蛋白为主的代乳粉中(分离大豆蛋白添加量限量为3%，表1)，蛋氨酸、精氨酸、亮氨酸和组氨酸4种氨基酸构成代乳粉的限制性氨基酸(图1-A、图1-B)，必须通过晶体氨基酸额外补平(图1-B、图1-C)。

2.3 幼虎代乳粉的饲喂效果

对18只新生东北虎幼虎和1只华南虎幼虎进行了全代乳粉人工育幼试验跟踪，幼虎基本信息、生长发育、采食情况和消化吸收情况等结果见表7、表8和图2、图3。

表7 虎代乳粉饲喂效果

续表7编号No.1)性别Sex初重 Birth weight/kg末重 Final weight/kg饲喂日龄Feeding days of age增重 Weight gain/kg平均日增重Average daily gain/(g/d)代乳粉采食量 Intake of milk replacer/kg2)增重效率Gain efficiency3)增重回归曲线Regression curve of weight gain1718-1母♀1.404.081～312.6886.451.8780.701y=0.082 4x+1.40 (R2=0.966)M36-14)公1.303.001～281.7060.711.6700.982y=0.061 2x+1.30 (R2=0.98)平均值±标准差Mean±SD5)80.89±10.110.59±0.09

图2 19只幼虎(来源于10只母虎)在完全代乳粉饲喂下体重变化曲线

如表7和图2可知，18只东北虎幼虎和1只华南虎在纯代乳粉喂养的前1个月内，呈现线性生长趋势(R2=0.96)，除了编号为1614-1和1614-2的2只幼虎初生重偏小(1 kg初生重)、生长缓慢以外，其他17只幼虎生长状况良好，该17只幼虎平均日增重为(80.89±10.11) g/d；增重效率为0.59±0.09，接近每摄食1单位代乳粉获得2单位的体增重。如图3可知，初生第1天，幼虎代乳粉体重采食比例为(1.35±0.42)%，变异系数为31.11%，这反映了不同个体采食能力存在较大的差别。第2～15天体重采食比例在2%以上[(2.24±0.19)%]，变异系数为8.65%，幼虎采食能力明显提高。第16～31天稳定在(1.80±0.06)%，变异系数为3.53%。由表8可知，对代乳粉饲喂条件下幼虎粪便形状进行了监测，幼虎粪便形态以糊状(54.55%)和条状(41.23%)为主，糊状和糊条状均为正常的幼虎粪便，腹泻情况较少出现(1.48%)。

图3 19只幼虎在完全代乳粉饲喂下代乳粉采食量/体重的变化曲线

表8 代乳粉饲喂条件下幼虎粪便形状分析

3 讨 论

本研究对6～10日龄华南虎母乳中氨基酸、脂肪酸、乳糖、常量矿物元素和微量矿物元素等营养物质进行了较为全面的成分检测和分析，提出了蛋氨酸、精氨酸、亮氨酸和组氨酸为“乳蛋白-乳糖”幼虎代乳粉的4种限制性氨基酸，发现母乳具有低乳糖、高蛋白质、高脂肪、脂肪酸结构接近1∶2∶1(饱和脂肪酸：单不饱和脂肪酸：多不饱和脂肪酸)、钙磷比例接近1∶1(实际检测结果为1.00∶1.15，表5)等组成特点，这些发现为幼虎代乳粉的科学开发提供了重要的理论参考。受限于一次麻醉取样有限(通常低于50 mL)以及研究中测定的项目较多，本研究中磷元素含量来自1只母虎的母乳样本，其他矿物元素含量均来自2只母虎的母乳样本，矿物元素中钙、钾、铜、锌等矿物元素含量稳定(CV值小于5%)，然而，镁、铁等矿物元素含量差异相对较大(CV值大于10%)，提示需要进一步跟踪虎乳中这些元素含量的变化。值得注意的是，赖氨酸通常是畜禽(如猪)饲粮中第一或第二限制性氨基酸，而本研究发现赖氨酸在虎母乳蛋白质中的含量均低于3种牛乳蛋白(全乳蛋白、乳清蛋白、乳酪蛋白)和大豆蛋白(图1-A)，因此，本研究中代乳粉并没有额外补充晶体赖氨酸，结合该代乳粉能够完全替代虎母乳的结果，本研究未将赖氨酸列为“乳蛋白-乳糖”型幼虎代乳粉的限制性氨基酸。

具体而言，华南虎母乳中氨基酸和脂肪酸含量非常高，二者之和为85.86%(绝干基础计算)，与非洲狮相近(乳蛋白+乳脂肪=90.43%)[8]。华南虎母乳中乳糖含量[(2.70±0.14)%，鲜乳计]低于家猫[9]、猎豹[10]、人以及奶牛、山羊、绵羊等常见经济动物鲜乳中乳糖含量(≥4%)[11]，而与非洲狮鲜乳中乳糖含量相近(2.65%)[8]。此外，脂肪酸中，饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量分别为26.137%、48.434%和25.168%，接近1∶2∶1的脂肪酸结构，而非洲狮母乳脂肪酸三者比例为3.2∶5.8∶1.0[8]，华南虎母乳中多不饱和脂肪酸占比高于非洲狮，然而虎乳中ω-6多不饱和脂肪酸/ω-3多不饱和脂肪酸为15.36∶1.00(表4)，过高的ω-6多不饱和脂肪酸/ω-3多不饱和脂肪酸被认为与较高的心脏病、肿瘤、感染以及自身免疫疾病等因素有关[12]。矿物质方面，虎乳中钙磷比例接近1∶1(实际检测结果为1.00∶1.15)。国外有关虎乳研究方面，只有巴西波梅罗迪一家动物园有报道过1只5岁、泌乳期为第8周的孟加拉虎(Bengal tiger)虎乳成分分析，该研究仅仅对虎乳中氨基酸含量进行了检测[13]，没有对虎乳中其他成分进行分析，也没有针对性开展幼虎代乳粉的研制。

根据华南虎母乳检测结果和特点分析，课题组开发了虎专用幼虎代乳粉，分别于东北虎虎园(哈尔滨)和福建梅花山华南虎繁育所(龙岩)对18只东北虎幼虎和1只华南虎幼虎进行了饲喂跟踪研究，从幼虎增重、采食情况、增重效率以及消化吸收情况来看，虎专用代乳粉取得了成功，但受制于目前营养和饲料加工技术水平，代乳粉只是严格按照虎母乳氨基酸成分进行配制，在总氨基酸和总脂肪酸含量方面仍然达不到虎母乳水平，后续将兼顾水溶性能、乳化性能、母乳相关指标的符合度等因素，进一步优化虎代乳粉，并采用生理生化、肠道微生物菌群、分子生物学等指标对研制的虎代乳粉进行深入评价。

4 结 论

① 华南虎母乳具有独特的营养成分构成，具有低乳糖、高蛋白质、高脂肪、脂肪酸结构接近1∶2∶1(饱和脂肪酸：单不饱和脂肪酸：多不饱和脂肪酸)、钙磷比例接近1∶1等组成特点。

② 开发的虎代乳粉可成功饲喂东北虎幼虎和华南虎幼虎。