补肾益智方可改善SAMP8小鼠记忆认知能力＊

张彩霞 张玉欣 接琳琳

（1.山东中医药高等专科学校，山东 烟台 204199；2.莒县中医医院，山东 日照 276500）

大量研究表明，60岁以后随着年龄的增长人的认知记忆能力逐渐衰退，主要表现为老年人进行性记忆功能、认知功能和行为功能等障碍，这都是老龄化的表现。而认知记忆能力衰退又进一步影响到老年人生活质量与活动能力[1]。目前，改善老年人认知能力衰退多用中药方剂调理，如补肾益智方、健脑益智汤、补阳还五汤等，通过保护海马神经元，而达到缓解的作用[2]。临床研究表明，补肾益智方可通过改善小胶质细胞介导的慢性炎症反应，从而改善阿尔茨海默病模型小鼠的学习记忆能力[5]，进而缓解老年遗忘型轻度认知功能障碍[3]。因此，本研究探讨应用补肾益智方对治疗老年型记忆衰退的作用，为防治老年人记忆衰退开辟一条新途径。

一、材料与方法

1.动物与分组

快速老化模型SAMP8小鼠 24只，3月龄，雄性，体质量为20～25 g。购自北京华阜康生物科技有限公司，动物许可证号 SCXK（京）2019-0008。饲养于山东中医药高等专科学校动物实验中心 SPF级动物实验室，动物实验室内小鼠可自由饮水，通风良好，自然光照，室温 （22±2）℃，明暗交替。适应性喂养2周。

将 SAMP8小鼠随机分为 3组，分别为模型组、补肾益智方中药低剂量组和补肾益智方中药高剂量组。模型组小鼠按体重给予生理盐水灌胃，低剂量中药组给予补肾益智方药液2.68 g/（kg·d）进行灌胃，高剂量中药组给予补肾益智方药液5.36 g/（kg·d）进行灌胃，连续灌胃6周。

2.仪器与试剂

Morris水迷宫测试软件和设备购于广州飞迪生物科技有限公司。苏木精-伊红（haematoxylin-eosin，HE）染色液购于碧云天生物技术有限公司。

3.方法

3.1 补肾益智方的制备 补肾益智方组成：熟地黄15 g、枸杞子20 g、山茱萸12g、盐益智仁6g、丹参15 g、当归10g、生白术10g、郁金10g、石菖蒲10 g、川芎10 g、人参12 g、远志6 g，以上药物经山东天江药业制成免煎颗粒。补肾益智方剂量设定是根据成人的临床给药剂量 1.34 g/kg·d的2 倍、4倍确立，低剂量补肾益智方药液终浓度为2.68 g/（kg·d）进行灌胃，高剂量补肾益智方药液终浓度为5.36 g/（kg·d）。药液配制完成后放置于 4℃冰箱冷藏备用，用前37℃温水浴后摇匀。

3.2 Morris 水迷宫测试试验 灌胃 42 d 后SAMP8小鼠可进行水迷宫适应训练。首先训练小鼠站台，将SAMP8小鼠置于平台上 1 min后，进行入水训练，小鼠由不同象限入水，1 min/次。每只SAMP8小鼠参与训练 2 次。若小鼠在规定时间内找不到站台，人为引导到站台，且停滞1 min。小鼠定位航行实验共进行 5 d，将平台转移至第三象限中心，分别于上、下午各进行试验1 次，试验时间为1 min/次。调整第一象限的池壁中点作为入新的水点，上午和下午均以相同顺序入水进行。若小鼠在60s内未能找到平台，人为将小鼠引导至平台，且在平台停滞 1 min，再将小鼠放回笼内。以小鼠入水后的逃避潜伏期设为观测指标，若小鼠在1min 内不能找到平台，记录为60s。定位航行试验结束后，次日上午撤除平台，进行小鼠空间探索试验。在第一象限入水，记录游泳轨迹，测量小鼠逃避潜伏期数据收集并进行比较分析。

3.3 动物取材及 HE染色 SAMP8小鼠 Morris 水迷宫试验完成后，模型组、补肾益智方高剂量组和补肾益智方低剂量组小鼠，乌拉坦麻醉后，4%多聚甲醛灌流固定，剥离小鼠大脑，将大脑置于预冷的4%多聚甲醛溶液，4℃固定过夜，脱水、透明、全脑修块、浸蜡、包埋，常规制作石蜡切片，进行HE染色，摄片。

4.数据处理

应用SPSS 22.0 统计分析软件，按独立样本 t 检验进行显著性检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.补肾益智方对 SAMP8模型小鼠 Morris 水迷宫逃避潜伏期的影响

在Morris 水迷宫定位航行试验中，随着训练次数的增加SAMP8模型小鼠的逃避潜伏期均呈下降趋势（表1）。与模型组相比，补肾益智方组逃避潜伏期均明显缩短。而高剂量组逃避潜伏期比低剂量组逃避潜伏期明显缩短。

表1 各组小鼠定位航行实验潜伏期用时比较（±s）

表1 各组小鼠定位航行实验潜伏期用时比较（±s）

注：与模型组比较，△P＜0.05。

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2.补肾益智方对SAMP8模型小鼠脑组织病理形态的影响

模型组小鼠的海马神经元排列紊乱、疏松，细胞结构不清晰。神经元数目减少，体积缩小，细胞核固缩呈不规则形。与模型组相比，补肾益智方组神经元排列紧密、整齐，轮廓相对清晰，未见核固缩等病理损伤。

三、讨论

我国是世界上老年人口最多的国家，而且也是人口老龄化发展速度最快的国家之一[5]。随着人口老龄化问题的日益加重，人们越来越多的关注于如何延缓衰老过程中记忆认知功能下降，促进记忆认知能力的发展，维持终生的脑健康。人类的老龄化过程会伴随大脑的结构和功能变化，从而导致老年人的反应迟缓、工作和情节记忆以及执行能力等记忆认知能力下降，而老年人的记忆认知损害又进一步影响到老年人日常生活质量与活动能力。目前，改善老年人记忆衰退多用中药方剂调理，如补肾益智方、健脑益智汤、补阳还五汤等，通过保护海马神经元，而达到缓解的作用。

补肾益智方是针对阿尔茨海默病肾精不足、气血亏虚的病理而设计的组方，具有补肾填精、益髓健脑、益气养血活血的功效[6]。研究表明补肾益智方能够降低阿尔茨海默症大鼠脑内谷氨酸（Gu）和天冬氨酸（Asp）的含量，导致抑制性γ氨基丁酸（Y-GABA）和氨基酸甘氨酸（Gly）的含量升高，从而有预防及缓解阿尔茨海默病症状的功效[7]。实验室水迷宫试验也表明，补肾益智方能够显著提高大鼠学习记忆能力[8]。本研究利用快速老龄化SAMP8小鼠为模型，补肾益智方连续灌胃6周后，在 Morris 水迷宫试验中发现模型组SAMP8小鼠有学习记忆功能受损的现象，而补肾益智方组小鼠的空间记忆学习功能有提高现象。表明补肾益智方能显著提高SAMP8小鼠学习记忆能力，且补肾益智方高剂量效果优于低剂量。通过HE染色观察，发现补肾益智方组能够减轻SAMP8小鼠脑组织病理变化，有良好的保护神经元的作用。这可能与抗细胞凋亡机制有关。

综上所述，本研究提示补肾益智方能改善老龄化引起的空间学习记忆认知障碍，表现为SAMP8模型小鼠行为学能力的提高及脑病理学变化，这可能与补肾益智方能够调控神经元凋亡机制密切相关。但是中药方剂具有靶点多、途径多的特点，中药方剂对神经元药物的相关机制还有不明确，有待于进一步深入研究。