医药院校黄芪多糖含药血清制备的实验研究＊

（山东中医药高等专科学校，山东 烟台 264199）

一、材料与方法

1.材料

1.1 实验动物和细胞

SPF级雌性SD大鼠，24只，体质量（180±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；人胃癌细胞株SGC7901购自上海美轩生物科技有限公司。

1.2 药物与试剂

黄芪多糖粉（APS）（纯度≥90%），购自山东中医药高等专科学校附属医院中药房。完全RPMI-1640培养基（批号：KGM31800S-500）购自江苏凯基生物技术有限公司；CCK8法细胞增殖检测试剂盒（批号：KGA317）购自江苏凯基生物技术有限公司。

1.3 仪器

CO2培养箱（BPN-80CW，上海一恒科学仪器有限公司）；荧光倒置显微镜（MF53，广州市明美光电有限公司）；多功能酶标仪（02L3006，TECAN）；离心机（TD4A，长沙英泰仪器有限公司）。

2.实验方法

2.1 黄芪多糖含药血清的制备

在无菌条件下将黄芪多糖粉末溶解于PBS，制成 4mg/mL液体。取24只正常健康的雌性SD大鼠，随机分为A、B、C三组。A、B两组以不同的给药途径给药。A组灌胃给药，B组腹腔注射、C组灌胃给予等量生理盐水。黄芪多糖给药量相当于临床黄芪注射液的等效剂量（成人用药量250mg/d），根据药理学实验设计与统计分析第三版“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值”表计算，大鼠黄芪多糖给药量应为22mg/d，而腹腔注射吸收率为80%左右，故B组大鼠腹腔注射的给药量为7mL/Kg。A灌胃给药量28 mL/Kg（灌胃吸收利用率为腹腔注射的35%～40% 左右）[12]三组大鼠均禁食相同时间（8～12小时），保持空腹状态下，在同一时间进行给药。连续给药10天。每次给药后8h及末次给药后1h，清醒状态下进行大鼠股动脉取血，连续采集10天，无菌分离血清，经56℃，35min 灭活补体后，超净台中用0.22μm 微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存备用。

2.2 SGC7901细胞培养

胃癌细胞SGC7901在10% 胎牛血清的RPMI1640 培养液（含青霉素、链霉素各 100 U/mL）中，置于37℃、5% CO2的培养箱进行常规培养。

2.3 CCK8法检测含药血清对SGC7901细胞生长的影响

实验设4组，分别为A组（灌胃给药组）、B组（腹腔注射组）、C组（空白血清组）以及Control组（阴性对照组），A、B组内再各分10个组（以血清采集日期分组），设3个复孔。取对数生长期SGC7901/ADR细胞以1×104个/孔接种于96 孔板的100μL培养液中，37℃、5%CO2条件下培养至其贴壁约70%，向完全培养基中按20%的比例分别加入黄芪多糖含药血清、空白血清等体积空白1640培养液。孔板置于培养箱中培养48h，每孔加入10μL CCK8检测溶液，再置于培养箱中孵育4 h，水平摇床上低速振荡混匀，在酶标仪上于波长450nm 处读取光密度值（OD值），比较药物效应的发挥。

2.4 统计学分析

所有数据均采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，定量资料采用平均数±标准差（X±s）表示，独立样本之间比较采用方差分析，以P＜0.05作为显著性差异。

二、结果

由表1可知，A组（灌胃给药组）当给药到第4天，与Control组及C组相比OD值明显降低（P＜0.05）。B组（腹腔给药组）当给药到第3天，与Control组及C组相比OD值明显降低（P＜0.05）。A组内从第6天开始与第4天相比OD值有明显差异（P＜0.05）。B组内第6天开始与第3天相比OD值有明显差异（P＜0.05）。

表1 不同方法制备的含药血清对SGC7901细胞增殖影响比较（OD值，X±s，n=3）

三、讨论

获取中药含药血清进行体外实验，可降低中药中非有效成分对实验结果造成的干扰。而含药血清制备受多种因素影响，如给药动物选择、给药剂量、给药间隔、采血时机、血清灭活及储存等条件的不同均会造成含药血清浓度的差异及效应的发挥。为了制备黄芪多糖含药血清，我们选择了两种不同的给药途径，其他因素基本一致（前述给药量的区别是为了尽量获取一致的血药浓度）以筛选较佳的黄芪多糖含药血清制备的方案。通过实验（见表），我们发现黄芪多糖含药血清对SGC7901细胞的生长有一定的抑制作用，A、B两组OD值比Control组和C组有降低趋势。A组，当给药到第4天其OD值比Control组和C组明显降低（P＜0.05），第6天比第4天OD值明显减低（P＜0.05），第6天到第10天的OD值无显著差异。B组，当给药到第3天其OD值比Control组和C组明显降低（P＜0.05），第6天比第3天OD值明显减低（P＜0.05），第6天到第10天的OD值无显著差异。本实验灌胃给药、腹腔注射给药，含药血清药效明显发挥在分别给药第4天和第3天，由此，说明黄芪多糖含药血清制备是切实可行的，且腹腔给药起效较早。A、B两组均在给药第6天血药浓度有所升高基本保持稳态，说明黄芪多糖在连续给药6天后达到稳态血药浓度。相对于灌胃给药，腹腔注射给药含药血清的OD值有下降趋势，说明腹腔注射给药含药血清浓度较高，可更好保证药效发挥。基于以上实验结果，我们选择腹腔注射给药的方式制备黄芪多糖含药血清，以保证较高的血药浓度，同时该方法也更接近临床给药途径。

在给药动物选择上一般选择与人类生物特性尽量相似的动物进行实验，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔等，本实验选择大鼠作为给药动物。根据对412种药物的半衰期、药物达峰时间等数据的分析，若以人为测试对象，每天给药2次，连续给药3天，末次给药后1h采血，80%以上的药物，其血浓度将大于其一次给药的最高血药浓度[13]。我们也参考在末次给药后1h采血制备黄芪多糖含药血清。

综上所述，黄芪多糖含药血清的制备我们制定如下的实验方案，采用健康大鼠，以临床黄芪注射液的等效剂量作为基础给药量，每天在固定时间腹腔注射给药，连续给药7天（本实验连续给药6天达稳态，为了确保血药浓度定连续给药7天），在末次给药后1h清醒状态下进行大鼠股动脉取血，无菌分离血清，经56℃，35min灭活补体后，超净台中用0.22μm 微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存备用。