一株H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定

方 超，张智明，李建华，何世岷

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

猪流行性感冒简称猪流感（Swine influenza，SI），是由A 型流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道传染病，主要临床症状为咳嗽、打喷嚏、发热、趴卧、食欲减退等[1-4]。猪流感的发病率极高，且传染性强，很难切断传播途径，一旦感染在短时间内可波及全群，对猪的生长性能造成不良的影响。单纯感染猪流感时死亡率并不高，但若与其他病原混合感染会使死亡率骤增，给养猪业造成严重的经济损失[5-8]。猪流感病毒的流行存在地域性，易发生变异，且具有数十种亚型。猪流感的流行特点导致免疫接种是目前防控该病的唯一有效手段，因此从发病现地分离病毒并制备疫苗对该病的防控尤为重要[9-10]。

1 材 料

疑似猪流感发病猪的鼻拭子样品8份，某猪场现地采集；HI 效价为1∶640 的猪流感病毒H1 亚型特异性阳性血清，HI 效价为1∶640 的猪流感病毒H3 亚型特异性阳性血清，HI 效价为1∶320 的猪流感病毒H5 亚型特异性阳性血清，HI 效价为1∶320的猪流感病毒H9 亚型特异性阳性血清，猪流感病毒H1N1亚型HA和NA基因阳性质粒，猪流感病毒H3N2 亚型HA 和NA基因阳性质粒，均由哈尔滨兽医研究所惠赠；病毒基因组DNA/RNA 快速提取试剂盒，购自北京博迈德生物技术有限公司；DL-2000 DNA Marker，宝生物工程（大连）有限公司产品；猪流感H1、H3、N1 和N2 的分型鉴定引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；1%鸡红细胞悬液，由哈药集团生物疫苗有限公司质量管理部参照现行《中国兽药典》制备保存；PBS 溶液，由哈药集团生物疫苗有限公司研发中心配制保存；SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；4～6周龄健康易感的阴性仔猪10头，购自哈尔滨市郊某猪场；其他试剂均为国产分析纯。

2 方 法

2.1 病料的处理

取出采集到的鼻拭子样品，充分振荡后分别取出鼻拭子中的液体置于无菌离心管中，标明序号，随后将样品经8 000 r·min-1离心10 min，取上清液保存于-70 ℃冰箱中，备用。

2.2 病毒的分离

将处理好的上清液无菌接种于10～11 日龄SPF鸡胚的尿囊腔，每个样品接种5枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.2 mL，接种后将鸡胚的接种孔封蜡并置于35 ℃、湿度为60%～65%的孵化箱中培养，每隔12 h检胚1次，24 h内死亡的鸡胚直接弃去，24 h后死亡的鸡胚逐一收获，培养72 h 取出全部鸡胚置于2～8 ℃冷却12 h以上，分别无菌收获鸡胚尿囊液并留样进行红细胞凝集试验。检出阳性样品，置于-70 ℃冰柜保存备用，盲传3 代仍为阴性的样品视为阴性，直接弃去（凝集价＜1∶16 判为阴性，凝集价≥1∶16判为阳性）。

2.3 半数鸡胚感染量（EID50）的测定

用PBS 液将分离获得的病毒液作10 倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74 个稀释度，分别经尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每枚鸡胚接种0.1 mL，置35 ℃、湿度为60%～65%的孵化箱中孵育观察72 h，逐个收获鸡胚的尿囊液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1∶16者判为感染，使用Reed-Muench法计算EID50。

2.4 病毒的鉴定

2.4.1 血清学鉴定

取检测为阳性的样品按照现行《中国兽药典》中方法配制4 HAU 抗原，分别与猪流感病毒H1、H3、H5、H9亚型特异性阳性血清中和，通过红细胞凝集抑制试验进行血清学鉴定。

2.4.2 分子生物学鉴定

取阳性样品，按剂盒说明书提取RNA。取10 μL RNA 进行反转录，反应体系为20 μL：依次加入 Radom Primer 1 μL，模板 RNA 10 μL，72 ℃5 min后冰浴5 min，再加入5×反转录酶Buffer 4 μL、10 mmol·L-1dNTP 2 μL、RNA 酶抑制剂 0.5 μL、M-MLV 反转录酶1 μL、dd H2O 1.5 μL，然后置于96 ℃5 min，37 ℃反转录1 h，用于PCR反应。

用猪流感病毒H1、H3、N1、N2 亚型分型鉴定引物进行PCR 鉴定，所扩增片段大小依次为320 bp、750 bp、738 bp 和 498 bp[11]。PCR 扩增体系为 25 μL：依次加入 10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，cDNA 1.0 μL，Taq酶0.5 μL，灭菌去离子水17.0 μL。PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，H1 型 53 ℃、H3 型 53.5 ℃、N1 型 52.5 ℃、N2 型 53 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，35 个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃终止循环。将扩增得到的产物于1%琼脂糖凝胶中电泳并与DL-2000 DNA Marker进行比较，得出试验结果。

2.5 病毒的纯化与鉴定

按照2.3 中方法，用PBS 液稀释分离到的病毒液，取 10-2、10-3、10-4、10-5、10-65 个稀释度接种SPF 鸡胚，每个稀释度接种5 枚鸡胚，每次仅收获阳性样品中最高稀释度的单胚尿囊液用于传代，连续纯化3 代后的病毒液作为F0 代，进行扩繁F1代。纯化后的病毒按照2.4.1、2.4.2 中的方法进行血清学及分子生物学鉴定。

2.6 病毒的电镜鉴定

将纯化后的病毒样品送至哈尔滨兽医研究所电镜室，进行电镜鉴定。

2.7 动物回归试验

从哈尔滨市郊购买4～6周龄健康易感的阴性仔猪10 头，随机选取5 头，分别经气管接种病毒含量≥106.0EID50·0.1 mL-1的纯化后的分离株病毒液4.0 mL，其余5头相同条件下饲养作为对照。攻毒后1～5 d连续测温，并观察记录猪流感特异性临床症状；攻毒后1～3 d，每天分别采集每头猪的鼻拭子并标记好耳号，参照2.2中方法对30份鼻拭子样品进行病毒分离，每份样品接种的鸡胚中有1枚鸡胚液红细胞凝集价≥1∶16，即判为病毒分离阳性。分离阴性的样品，应盲传1代，如仍为阴性，即判为病毒分离阴性；攻毒后5 d，对所有仔猪进行大体剖检，并观察肺部病变。

3 结果与分析

3.1 病毒的分离

按照2.2 中方法操作，其中1 份病料接种的鸡胚盲传2 代时收获的鸡胚尿囊液出现红细胞凝集，效价为1∶128，通过有限稀释法接种10～11 日龄鸡胚检测 EID50为10-5.32EID50·0.1 mL-1，结果见表1。病毒分离的胚体病理变化结果见图1。由图1 可见，接种后鸡胚的胚体出现水肿、出血等病理变化。

表1 病毒EID50测定结果

图1 猪流感病毒分离的胚体病理变化

3.2 病毒的鉴定

3.2.1 血清学鉴定

将分离获得的病毒进行血清学鉴定，可见病毒仅对猪流感病毒H3 亚型特异性抗血清发生阳性反应，结果见表2。表明所分离的毒株为H3 亚型猪流感病毒。

表2 红细胞凝集抑制试验鉴定结果

3.2.2 分子生物学鉴定

通过PCR 用所合成的引物对分离获得的病毒液进行流感病毒亚型的鉴定，结果见图2、图3。

图2 HA亚型鉴定结果

图3 NA亚型鉴定结果

由图2、图3 可知，仅由H3 和N2 亚型鉴定引物扩增的产物出现了目的条带，表明该样品的HA为H3亚型，NA为N2亚型。

3.3 纯化病毒鉴定

3.3.1 血清学及分子生物学鉴定

将分离到的病毒液参照2.5 中方法连续纯化3 代后扩繁，对扩繁的纯化后病毒进行血清学及分子生物学鉴定，仍表明分离株为H3N2亚型猪流感病毒。

3.3.2 病毒的电镜鉴定

分离到的病毒具有流感病毒的一般特征，病毒粒子直径为80～120 nm，有囊膜，且囊膜表面有放射状突起，即刺突和纤突。电镜观察结果见图4。

图4 猪流感病毒分离株电镜观察结果

3.3.3 动物回归试验

选用纯化后扩繁F2 代病毒液（病毒含量为10-6.16EID50·0.1 mL-1）进行攻毒试验，在临床症状、病毒分离和肺脏病变3个指标中有任意两项为阳性的仔猪判为发病，结果见表3。

由表3可知，攻毒组猪4/5发病，对照组猪5/5健活，表明分离株对猪具有较强的致病力。

表3 分离株病毒回归猪试验各项指标观察结果

分离株病毒攻毒后猪只肺部病理变化见图5。

由图5 可知，在攻毒猪肺脏的右尖叶、右心叶、左横膈叶、右横膈叶上有斑点状或斑块状肉样实变；病理切片表明，攻毒组肺泡壁增厚，肺泡上皮细胞增生，炎性细胞浸润，部分肺泡腔狭窄或闭塞。

图5 分离株病毒攻毒后肺部病理变化情况

4 结 论

本研究从现地采集疑似猪流感发病猪的鼻拭子，分离获得1株红细胞凝集价、EID50与致病力均较高的纯净的H3N2亚型猪流感病毒，为后期的疫苗研究奠定了基础。