水通道蛋白4 小分子抑制剂的筛选和验证

王 楠, 郭 健, 闫 冰, 刘 晴, 张 磊,3, 许会静, 李 淼, 孙美艳

（1. 吉林医药学院基础医学院实验中心，吉林 吉林 132013；2. 吉林医药学院检验学院实验中心，吉林 吉林 132013；3. 吉林省抗体工程科技协同创新中心，吉林 吉林 132013；4. 吉林大学中日联谊医院神经外科，吉林 长春 130033）

视神经脊髓炎（neuromyelitis optica， NMO）是一种选择性的累及视神经和脊髓的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，临床上以视神经和脊髓同时或相继受累为主要特征，呈进行性或缓解与复发交替的病程［1］。该病由Devic 于1894 年首次描述，又被称为Devic 病，既往认为NMO 是多发性硬化的一种亚型，但随着水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）自身抗体的发现，多数学者达成共识，NMO 是独立于多发性硬化的自身免疫性膜通道病［2-3］，具有其自身的发病机制和临床特点。NMO 的发病机制尚不完全明确，研究［4-5］表明：NMO 的主要发病环节是在血清和脑脊液中出现了针对髓鞘星形胶质细胞膜上AQP4 的自身抗体NMO-IgG，NMO-IgG与AQP4 结合导致星形胶质细胞膜上水通道蛋白功能障碍而发病。因此如何有效地阻断NMO-IgG 与星型胶质细胞膜表面AQP4 结合，成为NMO 治疗的关键。基于这一策略，有研究［6-7］合成了一种具有高亲和力、非致病性的单克隆抗体aquaporumab，其可以与致病性NMO-IgG 抗体竞争性结合AQP4，从而达到缓解疾病的目的。但这些抗体可能激活补体系统产生NMO 类似的病理变化，从而减弱其保护作用。因此，目前亟待研发毒性小、阻断效果明显的小分子化合物，尤其是直接作用于星型胶质细胞表面AQP4 进而阻断NMO-IgG 与AQP4 结合的小分子化合物。neosutchuenenine 是从北豆根植物中分离出来的一种双苄基异喹啉类生物碱。本研究利用表达hAQP4-M23 的FRT-AQP4细胞系和NMO 患者血清通过电化学发光的方法筛选出该化合物为AQP4 小分子阻断剂，并对天然小分子阻断剂的活性进行分析，从根本上阻断由于NMO-IgG 与其抗原AQP4 结合这一关键环节所引发的一系列病理过程，为治疗NMO 的新药开发及指导NMO 临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器FRT-AQP4 辽宁医学院馈赠，V79-AQP4 细胞为意大利巴里大学馈赠。NMO 血清样本来自北京宣武医院、辽宁省人民医院和吉林大学中日联谊医院，DMEM 高糖培养基（美国Sigma 公司），BSA（美国BBI 公司），胎牛血清（美国Hyclon 公司），Alex Fluo488 羊抗兔和Alexa Fluor 555 标记的抗人IgG 二抗（美国Invitrogen 公 司），兔 抗AQP4 抗 体 和HRP 标 记的抗人（美国Santa Cruz 公司），人补体（美国Sigma 公司），Cell Titer-Glo®发光测定试剂盒（美国Promega 公司），水溶性四氮唑1（water solubility tetrazole-1，WST-1）细胞活力检测试剂盒和酶联免疫吸附试验 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）细胞凋亡检测试剂盒（瑞士Roche公司）。细胞培养箱（美国Thermo 公司），IX71 型荧光显微镜（日本Olympus 公司）， Fluostar Optima 多功能酶标仪（德国BMG 公司）。

1.2 高通量筛选细胞接种于96 孔细胞培养板（黑壁透明底） 中进行培养，当细胞融合度约为90%时进行筛选。以FRT-AQP4 细胞不加小分子化合物的最后一列为阴性对照，以FRT-null 细胞不加小分子化合物的第1 列为阳性对照，其余80 孔为检测孔。每个孔采用PBS 缓冲液洗涤3 次，4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定10 min，3%BSA 封闭30 min（100 μL/孔）。每孔中加入中药小分子单体化合物或者中药组分，室温孵育15 min。PBS 缓冲液洗涤细胞2次，加入NMO 患者血清，37 ℃下孵育1 h。PBS 缓冲液洗涤细胞2次，加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗人二抗，室温孵育1 h。PBS 缓冲液洗涤3 次后，加入HRP 的化学发光底物［增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）］以测量HRP 活性。采用终点检测法测定化学发光，整合时间为100 ms，等待5 min 后，检测每孔的化学发光强度，以荧光强度表示HRP 活性，保存记录，原理见图1。

1.3 免疫染色法检测neosutchuenenine 阻断NMO-IgG 与AQP4 的结合作用表达AQP4-M23的V79-AQP4 细胞 培 养24 h， PBS 缓 冲 液 洗 涤3 次， 3%BSA 在 室 温 下 封 闭 细 胞1 h。 加 入neosutchuenenine 或二甲基亚砜（DMSO），室温孵育15 min，加入NMO 患者血清或非NMO 患者对照血清（1∶200）4 ℃过夜。PBS 缓冲液洗涤V79-AQP4 细胞3 次，加入Alexa Fluor 555 标记的山羊抗人IgG 二抗（1∶400）温育30 min。AQP4 免疫荧光染色时，将V79-AQP4 细胞在4%PFA 中室温固 定10 min， 0.5%Triton X-100 通 透10 min，3%BSA 封闭1 h 后，加入兔抗AQP4 抗体（1∶200）室温孵育2 h，Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔IgG（1∶200）二抗孵育30 min，荧光显微镜观察荧光强度。

1.4 荧光淬灭法检测neosutchuenenine 对细胞水通透性的作用本实验采用钙黄绿素荧光猝灭法检测细胞膜的通透性。将细胞接种到96 孔细胞培养板（黑壁透明底） 中培养24 h，细胞单层铺满孔底，PBS 缓冲液冲洗2 次，加入5 μmol·L－1calcein-AM，室温孵育15 min。弃去calcein，PBS 缓冲液冲洗2 次，加入300 mOsm 的等渗PBS 缓冲液，FluorStar 荧光测定3 s 后自动向孔中加入500 mOsm 的高渗PBS 缓冲液，继续测定30s，生成全程曲线。荧光值从加液开始到淬灭最低为止所用的时间以τ 表示，以1/τ 表示细胞的水通透性。

1.5 Cell Titer-Glo® 发光法检测补体依赖的细胞毒性将细胞与neosutchuenenine 或DMSO 孵育15 min，以正常人的血清（1∶200） 作为阴性对照，加入NMO 患者血清和5%人补体于37 ℃孵育1 h。每孔中加入100 μL CellTiter-Glo®试剂，震荡混匀5 min 后，室温孵育25 min， Fluostar Optima酶标仪进行检测。

1.6 WST-1 法检测neosutchuenenine 作用下细胞活性采用细胞活力试剂盒和1 种四唑盐试剂WST-1 快速检测细胞活性。加细胞悬液100 μL 到96 孔细胞培养板，37 ℃、5% CO2孵育过夜，采用一定浓度的neosutchuenenine 处理细胞24 h，在每孔中加入10 μL WST-1溶液，37 ℃孵育1 h，在酶标仪450 nm 处测定吸光度（A） 值，以A 值表示细胞活性。

图1 NMO-IgG 与AQP4 结合的天然小分子阻断剂筛选原理示意图Fig.1 Schematic diagram of screening principle of natural small molecules inhibitors of binding of NMO-IgG to AQP4

1.7 ELISA 法检测neosutchuenenine 作用下细胞凋亡情况采用ELISA 细胞凋亡检测试剂盒，通过定量检测细胞死亡后相关DNA 片段反映细胞的凋亡。将neosutchuenenine 与70%融合度的细胞作用24 h 后，将细胞裂解物置于链霉亲和素包被的微孔板中，加入80 μL 免疫反应试剂（含生物素标记的抗DNA-POD 和抗组蛋白的抗体），室温孵育2 h，加入ABTS 底物100 μL，室温孵育15 min，在405 nm 处 检 测A 值。

1.8 统计学分析采用Graphpad Prism 7 统计软件进行统计学分析。采用Shapiro-Wilk 检验法分析各组数据的正态分布。各组细胞中水通透性水平、细胞毒性水平、细胞活性和细胞凋亡水平均呈正态分布，以±s 表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，2种细胞不同浓度样本均数比较采用双因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 化学发光法检测小分子对NMO-IgG 与AQP4结合的抑制作用本研究利用稳定转染AQP4-M23亚型的FRT 细胞为抑制剂筛选模型，从含有50 000 种中药粗提物组分进行初步筛选，结果表明：与FRT-AQP4 组比较，分离出的4 个连续组分的化学发生强度明显降低，即HRP 活性明显升高（P＜0.01），表明该4 种组分对NMO-IgG 与AQP4 的结合具有明显的抑制作用。与DMSO 组比较，这些组分在二次筛选中HRP 活性明显升高（P＜0.01），表明筛选出的4 种组分对NMO-IgG依赖的补体细胞毒性具有明显的抑制作用。对该中药的活性成分进行分离和鉴定，鉴定出1 种名为neosutchuenenine 的小分子。见图2。

2.2 免疫染色法检测neosutchuenenine 对NMOIgG 与AQP4 结合的抑制作用采用免疫荧光法分析neosutchuenenine 对NMO-IgG 与AQP4 结 合 的 抑制作用。在DMSO 或neosutchuenenine 作用下，将V79-AQP4 细胞与NMO-IgG 孵育、固定和通透后，加入Alexa Fluor 555 偶联二抗。与DMSO 组比较，将细胞与neosutchuenenine 孵育后，红色荧光减弱。同时，使用抗C 末端的AQP4 抗体和Alexa Fluor 488 标记的二抗检测AQP4 的表达，与DMSO 组比较，neosutchuenenine 实验组抗C 末端AQP4 抗体产生的绿色荧光无明显变化，表明neosutchuenenine抑制了NMO-IgG 与AQP4 的结合，不影响AQP4的正常表达。见图3。

图2 4 种连续组分对NMO-IgG 与AQP4 结合的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of four fractions on binding of NMO-IgG to AQP4

2.3 荧光猝灭法检测neosutchuenenine 作用下细胞 水 通 透 性与 DMSO 组 比 较，加 入neosutchuenenine 后，calcein 荧光值变化速率无明显变化（荧光值变化曲线1/τ 表示细胞的水通透性）。表明neosutchuenenine 不影响V79-AQP4 细胞对水的通透性。见图4。

2.4 CellTiter-Glo® 发光法检测neosutchuenenine作用下补体依赖的细胞毒性将V79-AQP4 细胞与neosutchuenenine 或DMSO 孵育15 min，以正常人血清（1∶200）作为阴性对照，加入NMO 患者血清和5%人补体，通过CellTiter-Glo®发光法检测neosutchuenenine 的细胞毒性。与non-NMO 组比较，NMO 组随抑制剂浓度的升高，相对发光强度增高，表明neosutchuenenine 以浓度依赖性方式增加了NMO-IgG /补体处理的V79-AQP4 细胞的活性。见图5。

图3 免疫荧光法检测neosutchuenenine 对NMO IgG 与AQP4 结合的抑制作用(Bar=50 μm)Fig.3 Inhibitory effects of neosutchuenenine on binding of NMO IgG to AQP4 detected by immunofluorescence method（Bar=50 μm）

2.5 WST-1 法检测neosutchuenenine 作用下细胞活性与DMSO 组比较，2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、 100.0 和200.0 μmol·L－1neosutchuenenine在450 nm 处A 值无明显变化（P＞0.05），且各组间细胞A 值比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明在本研究使用的neosutchuenenine 剂量范围内，细胞增殖差异无统计学意义。见图6。

2.6 ELISA 法检测neosutchuenenine 作用下细胞凋亡情况细胞凋亡的发生是由于钙-镁依赖性核酸酶切割DNA 后产生大量核小体片段，核小体含有组蛋白，采用双抗体夹心酶免疫法，可进行比色法分析细胞凋亡情况。与DMSO 组比较，2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 和200.0 μmol·L－1neosutchuenenine 组405 nm 处A 值差异无统计学意义（P＞0.05），且各组间细胞A 值比较差异无统计学 意 义 （P＞0.05），表 明 在 本 研 究 使 用 的neosutchuenenine 剂量范围内，细胞凋亡差异无统计学意义。见图7。

3 讨 论

图4 neosutchueneninel 作用下V79-AQP4 细胞水通透性Fig. 4 Water permeabilities of V79-AQP4 cells after treated with neosutchuenenine

水通道蛋白（aquaporin，AQP） 是一类特异性快速转运水和其他小溶质的细胞膜通道类蛋白家族［8-14］。迄今为止，在已鉴定的13 种同源AQP中，AQP4 引起了越来越多的关注。研究［15-18］显示：AQP4 对耳聋和脑水肿的形成有重要作用，并且 是NMO自身抗体NMO-IgG 的靶抗原［19-20］。NMO 患者血清中抗AQP4 的NMO-IgG 自身抗体与AQP4 的结合增强了NMO 的血管周围炎症特性，引起血脑屏障的破坏，是NMO 发病的主要环节［21-22］。目前，临床上NMO 的治疗主要是对症治疗，如甲基泼尼松龙、免疫抑制和血浆置换等，但只能在一定程度上缓解患者的症状，不能从根本上治愈NMO［23-24］。可见，NMO-IgG 与AQP4 结合的抑制剂成为NMO 的潜在治疗候选物。理想的抑制剂应有效阻断NMO-IgG 与AQP4 的结合而不损害其他细胞。在以往的研究［25］中鉴定了NMO-IgG与AQP4 结合的抑制剂异粉防己碱，使用补体依赖的细胞毒性（complement dependent cytotoxicity，CDC） 实验证明了异粉防己碱的活性，证明了异粉防己碱具有低细胞毒性，且不影响AQP4 的水转运功能。本研究分析了双苄基异喹啉类生物碱中neosutchuenenine 小分子对NMO-IgG 与AQP4 结合的抑制作用，表明neosutchuenenine 抑制了依赖NMO-IgG 的补体细胞毒性。

图5 neosutchuenenine 作用下各组V79-AQP4 细胞毒性Fig.5 Cytotoxicities of V79-AQP4 cells in various groups after treated with neosutchuenenine

图6 neosutchuenenine 作用下各组V79-AQP4 细胞活性Fig.6 Activities of V79-AQP4 cells in various groups after treated with neosutchuenenine

图7 Neosutchuenenine 作用各组V79-AQP4 细胞凋亡情况Fig.7 Apoptosis of V79-AQP4 cells in various groups after treated with neosutchuenenine

北豆根属于防己科类植物蝙蝠葛（ManispernumdaericumDC.） 根茎，主要出产在东北、华北及山东和陕西等不同地域［26］，其性味苦寒，能清热解毒，有小毒，能祛风且止痛，普遍用于治疗咽喉肿痛、风湿痹痛和肠炎痢疾等病症［27-28］。目前已从北豆根中分离出生物碱类、酚酸类、醌类、醇类、挥发油和多糖等多种成分。其中，生物碱类成分是其主要生物活性成分，可为双苄基四氢异喹啉型生物碱、氧化异阿朴啡型生物碱、吗啡烷型生物碱、阿朴啡型生物碱、原小檗碱型生物碱、异喹啉和异吲哚型生物碱，这些生物碱类成分常作为北豆根质量控制的指标［29-31］。本研究中分离的小分子化合物neosutchuenenine 是一种双苄基异喹啉类生物碱，该分子抑制了NMO-IgG 与AQP4 结合，有效降低NMO-IgG 补体处理过的V79-AQP4 细胞中的补体依赖性细胞毒性，且不影响V79-AQP4 细胞的增殖和凋亡。因此，具有生物活性的天然小分子阻断剂neosutchuenenine 的分离和鉴定为有效治疗NMO 提供了新思路。