冠状动脉粥样硬化性心脏病患者外周血单核细胞亚群CX3CR1表达的变化及意义

赵 倩，高 霖，王长谦，张俊峰，张绘莉，卓 杨

上海交通大学医学院附属第九人民医院心血管内科，上海200011

2010 年，国际免疫学联合会（International Union of Immunological Societies，IUIS）命名委员会根据单核细胞表面标志物CD14 和CD16 表达的差异，将人类单核细胞分为3 个亚群［1］：①CD14+CD16-（简称为Mon1），为经典型单核细胞亚群，占总单核细胞的80%～85%。②CD14+CD16+（简称为Mon2），为中间型单核细胞亚群，占比约5%。③CD14-CD16+（简称为Mon3），为非经典型单核细胞亚群，占比5%～10%。目前，有关单核细胞亚群的比例及其功能变化的研究越来越多，如与心血管疾病之间的关系研究等，但具体的作用机制尚未被阐明。本研究通过观察不同类型冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease，CHD）患者外周血单核细胞亚群趋化因子CCL2（C-C motif chemokine ligand 2）、CX3CL1 （C-X3-C motif chemokine ligand 1）及 其 受 体CCR2 （C-C motif chemokine receptors 2）、CX3CR1（C-X3-C motif chemokine receptor 1）表达水平的变化，探讨这些单核细胞亚群的趋化因子受体、亚群比例与CHD远期预后的关系以及可能的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2014 年1—6 月于上海交通大学医学院附属第九人民医院心血管内科住院的CHD 患者63 例。纳入标准：①年龄18～25岁。②以胸闷、胸痛症状就诊。③冠状动脉造影（coronary angiography，CAG）结果为阳性。排除标准：①患有各类感染性疾病。②患有扩张性心肌病、瓣膜性心脏病、慢性心力衰竭、缺血性心肌病、严重肝肾功能不全、恶性肿瘤、血液系统疾病、结缔组织疾病。③长期服用免疫抑制剂。

本研究已通过上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会的审批（审批号：2015117）。所有入组患者均签署了知情同意书。

1.2 患者资料收集

对患者的如下资料进行收集。①一般资料，包括年龄、性别、体质量指数（body mass index，BMI）。②临床资料，包括心血管危险因素，如冠心病家族史、吸烟史、合并高血压或糖尿病，心血管药物的应用，药物包括抗血小板药物、他汀类药物、血管紧张素转换酶抑制剂/血管紧张素受体拮抗剂（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI/angiotensin Ⅱreceptor antagonist，ARB）及β受体阻滞剂，心电图，CAG结果和Gensini冠脉评分。③检测指标，包括外周血单核细胞趋化因子及其受体、心肌损伤标志物［肌钙蛋白I（Troponin I，cTnI）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）］、白细胞（white blood cell，WBC）总数、WBC 分类计数（包括中性粒细胞计数、单核细胞计数、淋巴细胞计数）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-Ch）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-Ch）、三酰甘油（triacylglycerol，TAG）、肌酐、空腹血糖、同型半胱氨酸、超敏C 反应蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）、收缩压（systolic blood pressure，SBP）及舒张压（diastolic blood pressure，DBP）。

1.3 外周血单核细胞趋化因子及其受体的检测

1.3.1 CCR2、CX3CR1 表达水平及单核细胞亚群分析 入院24 h内采集患者的静脉全血，注入乙二胺四乙酸抗凝管中，于2 h 内进行检测。参照相关说明书，通过FACSCalibur流式细胞仪对CCR2和CX3CR1的表达水平进行检测。实验所用抗体单克隆小鼠抗人CD14（PE-CyTM5.5标记）、CCR2（PE 标记）和CX3CR1（FITC 标记）均购于美国BioLegend公司。在观察分析时，通过侧向散射光和根据CD14的表达，圈定需要观察的单核细胞亚群；收集CCR2 和CX3CR1 的荧光信号，分析其表达水平，并结合IUIS的单核细胞亚群命名规则，将单核细胞分为3个亚群，即CCR2+CX3CR1-（Mon1）、CCR2+CX3CR1+（Mon2）和CCR2-CX3CR1+（Mon3），对亚群比例进行分析。

1.3.2 血清CCL2和CX3CL1水平检测 采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）对血清CCL2 和CX3CL1 水平进行检测，具体操作参照ELISA检测试剂盒说明书。

1.4 分组情况

综合患者的心肌损伤标志物水平、心电图和CAG 结果，将其分为急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）组和稳定型心绞痛（stable angina pectoris，SAP）组；其中，ACS 组包括3 类患者，即ST 段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）患者、 非ST 段抬高型心肌梗死（non-ST segment elevation myocardial infarction，NSTEMI）患者和不稳定型心绞痛（unstable angina pectoris，UA）患者。

1.5 随访途径及内容

通过电话、门诊、再住院等方式，每3个月对患者进行1 次随访，内容为是否发生主要不良心脏事件（major adverse cardiac event，MACE）。该事件包括心源性死亡、致死性和非致死性缺血性脑卒中、再发心肌梗死、心力衰竭、再次行急诊或择期血运重建。

1.6 统计学方法

应用SPSS 23.0 软件对研究数据进行统计分析。符合正态分布的定量资料以±s 表示，采用t 检验进行2 组间比较，采用单因素方差分析进行多组间比较；不符合正态分布的定量资料以M（Q1，Q3） 表示，采用Mann-Whitney U 检验进行比较。采用多因素Logistic 回归模型对hs-CRP水平、WBC计数、单核细胞亚群比例、趋化因子水平等与MACE 发生的相关性进行分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般资料、临床资料和检测指标分析

在63 例CHD 患 者 中，ACS 组46 例（包 括12 例STEMI、15 例NSTEMI 及19 例UA 患者），SAP 组17 例。对2 组患者的一般资料、临床资料和检测指标进行分析，结果（表1）显示：与SAP组相比，ACS组患者的他汀类药物的应用比例、Gensini 冠脉评分及心肌损伤标志物水平均较高（均P=0.000）；且在ACS 组内，UA 患者的Gensini 冠脉评分、心肌损伤标志物水平均低于STEMI 患者，NSTEMI 患者的上述该2 指标均低于STEMI 患者，UA 患者心肌损伤标志物水平低于NSTEMI 患者（均P＜0.05）。

表1 不同类型CHD患者的一般资料、临床资料和检测指标比较Tab 1 Comparison of general data，clinical data and testing indexes in different types of CHD patients

Continued Tab

2.2 随访分析

在5 年的随访中，ACS 组共有14 例患者发生MACE；其中，STEMI 患者有1 例发生心源性死亡、2 例再次择期血运重建、1 例心力衰竭，NSTEMI 患者有1 例发生心源性死亡、3 例再次择期血运重建、1 例心力衰竭、1 例非致死性缺血性脑卒中，UA 患者有3 例发生再次择期血运重建、1 例非致死性缺血性脑卒中。SAP 组有1 例发生MACE（再次择期血运重建）。

2.3 患者WBC 总数和分类计数、hs-CRP 水平、CCL2和CX3CL1水平分析

如表2 所示，与SAP 组相比，ACS 组患者的WBC 总数、中性粒细胞计数、单核细胞计数、hs-CRP 水平、CCL2水平和CX3CL1水平均较高（均P＜0.05）；且在ACS组内，STEMI 患者的WBC 总数、hs-CRP 水平均高于UA患者和NSTEMI 患者，单核细胞计数高于UA 患者（均P＜0.05）。

表2 不同类型CHD患者的WBC总数和分类计数、hs-CRP水平、CX3CL1和CCL2水平比较Tab 2 Comparison of WBC count and differential count，and hs-CRP，CX3CL1 and CCL2 levels in different types of CHD patients

2.4 CCR2和CX3CR1的表达及相关亚群占比分析

通过流式细胞术检测及亚群比例分析，结果（表3）显示：与SAP 组相比，ACS 组患者的CCR2+CX3CR1+、CCR2-CX3CR1+亚群比例较高，CCR2+CX3CR1-亚群比例较低（均P=0.000）；且在ACS 组内，STEMI 患者的CCR2+CX3CR1-亚群比例低于NSTEMI 患者和UA 患者（P=0.004，P=0.008）。

表3 不同类型CHD患者的单核细胞亚群占比分析Tab 3 Analysis of monocyte subset proportion in different types of CHD patients

2.5 影响MACE发生的单因素和多因素Logistic回归分析

采用单因素Logistic 回归模型对不同类型CHD 患者WBC 总数、WBC 分类计数、CCL2水平、CX3CL1水平、hs-CRP 水平及3 种单核细胞亚群占比进行分析，结果显示hs-CRP 水平、CCR2+CX3CR1-比例、CCR2+CX3CR1+比例为MACE 发生的影响因素（均P＜0.05）。将上述3 个指标行多因素Logistic 回归分析，结果显示该3 个指标均为MACE发生的危险因素。

表4 影响MACE发生的单因素和多因素Logistic回归分析Tab 4 Univariate and multivariate Logistic regression analysis of MACE occurrence

3 讨论

单核细胞亚群的比例及其功能的异常是多种心血管疾病发生、发展的重要病理生理基础之一［2］。在冠状动脉粥样硬化的各个阶段，不同亚群的单核细胞在促进动脉粥样硬化形成、斑块破裂、心肌重构等方面发挥了独特的作用［3］。单核细胞亚群的迁移由趋化因子受体介导，且不同亚群表达趋化因子受体的种类也不相同，如Mon1主要表达CCR2，Mon2 和Mon3 主要表达CX3CR1［4］。本研究显示：单核细胞亚群比例及趋化因子CX3CL1水平在ACS组和SAP组间具有明显的差异；且在ACS患者中，单核细胞CCR2+CX3CR1-亚 群 明 显 减 少， CCR2+CX3CR1+和CCR2-CX3CR1+亚群的比例增加，同时伴随血清CX3CL1水平升高。单核细胞亚群表面标志物的不同决定了其功能状态的异质性［1］。既往研究［5-6］表明，在CX3CL1-CX3CR1介导下，单核细胞可通过迁移和黏附至损伤的内皮细胞来激活血小板，还可通过CX3CL1-CX3CR1 与血管平滑肌细胞相互作用，促进斑块的易损和破裂，导致急性冠脉事件发生。本研究所观察到的ACS 患者CCR2+CX3CR1+和CCR2-CX3CR1+单核细胞比例增加的现象可能与这一机制相关。本研究中ACS 组的3 类患者的单核细胞亚群比例特点也略有不同，如STEMI 患者的CCR2+CX3CR1-亚群比例较NSTEMI 患者和UA 患者明显减少，而CCR2+CX3CR1+亚群比例和CCR2-CX3CR1+亚群比例在3类患者间无明显差异；究其原因，可能与该3类疾病的发病机制仍略有区别相关。

在本研究中，ACS 患者中CCR2+CX3CR1-（Mon1）比例较SAP 患者显著降低，CCR2+CX3CR1+（Mon2）和CCR2-CX3CR1+（Mon3）比例显著增加。类似地，Schlitt等［7］应用多排螺旋CT 检查发现，斑块不稳定患者的Mon2 型单核细胞数量较斑块稳定者有显著增加；分析其原因，可能与Mon2亚群能够分泌多种促炎症因子、表达大量趋化因子受体（如CCR2、CX3CR1 和CCR5）有关。而上述特点也使Mon2亚群成为了重要的促动脉粥样硬化类细胞，与动脉粥样硬化的预后密切相关。本研究发现，Mon2与CHD患者5年MACE的发生相关。相关流行病学调查研究［8］显示，Mon2 亚群数量是高危慢性肾脏病透析患者发生心血管事件和死亡的独立预测因子之一。邹春霞等［9］发现，Mon2 亚群数量与STEMI 患者住院期间的死亡事件之间存在明显正相关，提示Mon2亚群数量可能具有一定的预后评估价值。因此，CCR2+CX3CR1+亚群比例或将成为临床上评估CHD 患者远期预后的新型生物标志物。

本研究尚存在一定的局限性：①检测的单核细胞亚群表面标志物有限。由于不同亚群的单核细胞表面均表达有大量的趋化因子受体和细胞因子受体，且在不同疾病状态下这些受体的表达均会发生不同程度的改变，因此仅检测CD14、CD16、CCR2 和CX3CR1 无法全面反映各个亚群表面标志物的变化情况。目前，最新研发的质谱流式技术可在单细胞水平同时检测近百种蛋白表达，未来可通过这一新技术对其加以更加精准的分析。②本研究为单中心、小样本研究，未在多个时间点动态随访单核细胞亚群趋化因子受体的变化，后续有待大规模的临床研究对本研究结果加以证实。此外，本研究还对11例CAG 阴性的对照患者进行了CX3CR1 和CCR2 检测，发现该类患者以Mon1 亚群为主，且随访5 年无MACE 发生，故而未纳入本研究。

综上所述，不同类型CHD 患者的单核细胞亚群趋化因子及其受体均呈特征性变化，且不同单核细胞亚群比例可能与CHD 患者的远期预后相关。未来可通过开展大规模的临床研究，进一步验证以CX3CR1和CCR2为特征的单核细胞亚群比例变化在CHD 患者长期预后中的意义和价值，为CHD 患者远期预后危险分层的评估和治疗策略的制定提供一定的帮助。