植物乳杆菌发酵鸭肉品质研究

王梦曼 韦彦安 孙京新,2* 周静萱 苗春伟

1.青岛农业大学食品科学与工程学院 山东青岛 266109 2.青岛特种食品研究院 山东青岛 266109

发酵肉制品是指在自然条件下或人工控制条件下，利用微生物或酶的发酵作用，使原料肉发生一系列生物化学变化以及物理变化，而形成具有特殊色泽、质地和风味及可以比较长时期保存的肉制品[1，2]。目前用于发酵肉制品生产的微生物有乳杆菌属、链球菌属、片球菌属、酵母菌属和青霉菌属。Fernández M[3](2016)等在一种经过自然发酵而成的猪肉肠中添加抗菌蛋白酶(EPg222)，讨论致病菌和抗腐败菌的一些功能。Arcila J A[4](2015)等利用木糖葡萄球菌发酵肉品，研究发现产生的硝酸盐还原酶、蛋白酶和脂肪分解酶可以保持肉类产品的颜色。Broncano J M[5](2011)等添加蛋白酶在香肠中，增加抗氧化稳定性。用肉糖葡萄球菌和植物乳杆菌这种蛋白酶混合发酵剂进行干香肠发酵，加速了制品中的蛋白质水解速度，让制品的成熟期提前，制品中游离氨基酸的量也发生了明显增加。Chen Q[6](2016)等利用戊糖片球菌、弯曲乳杆菌和木糖葡萄球菌的发酵剂混合物发酵哈尔滨干肠，使风味得以改善。

在发酵肉过程中，植物乳杆菌能够产生蛋白质酶和脂肪酶分解蛋白质和脂肪，从而形成易于人体消化吸收的游离氨基酸和脂肪酸。同时在发酵过程中形成烃、醛、酮等呈味物质来改善产品风味。阮一凡[7](2020)等利用植物乳杆菌和酿酒酵母菌发酵鸭腿，赋予产品良好风味并延长了产品货架期。石江涛[8](2015)等利用戊糖片球菌和嗜酸乳杆菌发酵的鸭肉具有良好的味道和口感。当前，国内外生产的发酵肉制品大都采用生鲜肉为原料进行发酵，利用乳酸菌和葡萄球菌为主发酵剂进行纯菌或者混菌发酵[9，10]。生鲜肉在发酵成熟的过程中，起主要作用的是肉中固有蛋白酶、脂肪酶，起次要作用的是微生物发酵。

发酵食品历史悠久。西方国家早期生产传统西式发酵香肠。在我国有些地区生产基于乳酸菌的肉类产品。本文以植物乳杆菌为发酵剂，首先将生鸭肉高温灭菌，使其自身的酶失活，利用植物乳杆菌生长代谢中产生的丰富的酶对其进行酶解，此过程中微生物的发酵作用将占主导地位。

1 材料与方法

1.1 材料

植物乳杆菌，山东中科嘉亿生物工程有限公司；

鸭胸肉，青岛市城阳区大润发超市；

试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

质构仪TA-XT2i，英国Stable Micro System公司；

显微激光拉曼光谱仪HR800，法国Jobin-Yvon公司；

气相色谱(gas chromatography，GC)-质谱(mass spectrometry，MS)联用仪7890A-5975C，美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳杆菌悬液的制备

将冷冻的植物乳杆菌解冻后接入配好的肉汤培养基中，在MRS平板上划线，在37℃无氧条件下培养24h。培养后挑取单个菌落到10mL MRS平板中培养，并在37℃条件下静置24h。最后在37℃条件下以2%接种进一步培养12h，培养物以8 000r/min，4℃离心10min后，倒去上层培养基，用无菌生理盐水配成109cfu/mL的菌悬液备用。

1.3.2 发酵肉样品制备

将新鲜鸭胸肉用手术刀切下并绞成肉糜后用模具压成肉片，每份取4片置于10cm培养皿中。在121℃、0.1MPa条件下灭菌15min。冷却至室温。将制备好的植物乳杆菌悬液无菌操作下以5%接种量接种于鸭肉中。密封在20℃恒温条件下发酵，分别于鸭肉发酵过程中第0、3、5、7、9、12、14、17天观察对照组和发酵鸭肉制品。

1.3.3 发酵过程中质构测定

在常温条件下取3.0cm×3.0cm×1.0cm的样品用TA-XT2i质构仪(英国Stable Micro Systems公司)测试发酵过程样品，3次重复。依据Park W[11](2016)等的方法，探头型号P/0.5 R柱，用TPA二次下压；探头型号P/0.5 R柱，试验前速度为2.0mm/s，试验速度为1.0mm/s，测试后速度5.0mm/s，下压距离8.0mm，触发5.0g。测定参数：弹性，硬度，黏度。

从TPA实验特征曲线得到计算参数：硬度=第一个最高点；弹性=4～5间时间/1～2间时间；粘性=4～6和1～3之间的曲线所包围的区域；粘着性=硬度×内聚性。

1.3.4 拉曼光谱

依据Chen H[12](2011)等的方法,将对照组和植物乳杆菌发酵鸭肉样品通过显微激光拉曼光谱仪(JY Labram HR 800，法国Jobin-Yvon公司)测定，激光器为785nm，功率为100mw，光谱的获得条件为开孔200μm，600g/mm光栅，进行3次扫描，积分时间为60s，分辨率为2cm-1，数据获取速度为120cm-1/min，获取的拉曼光谱在300～3 500cm-1。通过比较多肽和蛋白质拉曼光谱获得氨基酸侧链光谱条带和肽键骨架振动分配[13～15]。每个样品测试3次,测试完成后用显微激光拉曼光谱仪中软件Labspec对光谱进行平滑处理。蛋白质的二级结构(随机卷曲，β-折叠，α-螺旋和β-转角)的含量可以通过曲线拟合结合傅里叶反卷积计算得到[16]。

1.3.5 气相色谱-质谱(GC-MS)

将对照组和植物乳杆菌发酵鸭肉样品，分别用刀具将制品弄碎成肉糜，并在4～8℃条件下发酵一段时间后，各取5g于固相微萃取瓶中。萃取头于气相色谱进样口中，在280℃条件下老化60min后，提取头插入瓶顶。在60℃条件下萃取60min，吸附结束后，取出萃取头，再于气相注射仪中在250℃条件下解吸2min。

GC-MS色谱条件：运用TR-5-MS毛细管色谱柱(31m×0.25mm，0.26μm)。

升温程序：起始柱温40℃，保持2min，以5℃/min至195℃，再以10℃/min至225℃，保留11min，运行总时间51min。

检测温度240℃；载气为He；流速1.6mL/min；恒压13.02kPa；离子源温度240℃；电子能量70ev。

电脑跟数据库匹配。定性结果使用一定程度的匹配和反匹配大于800。对挥发性风味成分的定量分析采用相对含量(%)按峰面积归一化法处理。

2 结果与分析

2.1 质构

硬度是成熟程度的量度，与鸭肉蛋白质的变性、水解以及水分耗损有关[17]。从发酵开始，植物乳杆菌发酵鸭肉硬度比对照组(未发酵鸭肉)显著降低(p<0.05)(图1)。是由于植物乳杆菌繁殖生长，蛋白酶产生代谢产物蛋白酶，将样品中的蛋白分解成为小分子的蛋白、胨以及小肽等。制品的含水量、脂肪含量和蛋白质含量会对硬度有影响[18]。李小妮[19](2020)等用不同的菌种对腊肠进行发酵，得出结论，添加植物乳杆菌可以缓解肉品的硬度。

图1 发酵过程中鸭肉制品硬度变化Fig. 1 Hardness changes of duck meat products during fermentation

本研究中发酵鸭肉在成熟过程中，溶胶会不断转变为凝胶，从而提高鸭肉的硬度，但同时，由于蛋白质具有降解作用，硬度会降低。发酵前7d，植物乳杆菌发酵鸭肉与对照组(未发酵鸭肉)弹性无显著差别(p>0.05)；发酵7d后，植物乳杆菌发酵鸭肉弹性比对照组(未发酵鸭肉)显著降低(p<0.05)(图2)。本研究中发酵鸭肉在发酵过程中蛋白质水解程度的不断增加，产生大量水溶性物质，导致蛋白质的网状结构被破坏，样品弹性出现下降趋势。

图2 发酵过程中鸭肉制品弹性变化Fig. 2 Elasticity changes of duck meat products during fermentation

Kargozari M[20](2014)等利用4种配方发酵香肠，得出结论中其发酵香肠弹性变化范围与本研究中植物乳杆菌发酵鸭肉相似。发酵前7d，植物乳杆菌发酵鸭肉与对照组(未发酵鸭肉)黏性无显著差别(p>0.05)；发酵7d后，植物乳杆菌发酵鸭肉黏性比对照组(未发酵鸭肉)显著增大(p<0.05)(图3)。这与植物乳杆菌生长旺盛有关，发酵7d后菌丝体分泌物变多，水分含量升高，因此产品黏性增大。Laranjo M[21](2015)等通过研究干发酵香肠，得出结论黏度随着发酵时间的进行呈上升趋势。

图3 发酵过程中鸭肉制品黏性变化Fig. 3 Viscosity changes of duck meat products during fermentatio

2.2 蛋白质二级结构

蛋白质的二级结构主要包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等不同类型。拉曼光谱图中，酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅲ带具有较强的拉曼效应并且极少受到其他分子群的干扰，所以在分析和鉴定蛋白质二级结构时，把酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅲ带作为可靠依据[22]。如图4所示，在拉曼光谱中，酰胺Ⅰ带的范围为1 600～1 700cm-1，其中，1 645～1 657cm-1是高α-螺旋含量的蛋白质在拉曼光谱上的条带中心所在的区域；β-折叠结构为主的条带位于1 665～1 680cm-1；1 680cm-1为β-转角含量高的蛋白质的条带所在区域；无规则卷曲结构在1 660～1 665cm-1范围内。在酰胺Ⅲ带的范围中，表征不同结构的谱带有部分重合的区域，高α-螺旋含量的蛋白质主要在1 260～1 300cm-1处，在含量范围内，与β-转角存在重合区域；β-折叠在1 238～1 245cm-1处；无规则卷曲结构出现在1 250cm-1处[23]。

图4 对照组(A)与植物乳杆菌发酵鸭肉制品(B)蛋白质拉曼光谱(500～2 500cm-1)Fig. 4 Control (A) and Lactobacillus plantarum fermentation of duck meat products (B) Protein Raman spectroscopy (500～2 500cm-1)

植物乳杆菌发酵鸭肉产品中含有的蛋白质二级结构的每一种的含量，可以在图5中看出来。在加入植物乳杆菌后，α-螺旋含量由62%显著减少到43%(p<0.05)；β-折叠含量由18%显著增加到32%(p<0.05)；β-转角和无规卷曲含量增加不显著(p>0.05)。常荣[24](2019)等发现蛋白质二级结构中的β-折叠含量会随着氢键的增多而增多，而且，通过提高NaCl添加量，也会提升α-螺旋结构解折叠，形成β-折叠结构。Barrtee T W[25](1978)等通过研究，无机盐作用于肌动蛋白，这是由于多肽链间氢键增加引起蛋白质α-螺旋含量降低。Wu Z[26](2006)等也通过研究，得出结论NaCl含量超过3%同样会导致α-螺旋含量降低。多肽链间氢键的数量会影响β-折叠的形成，同时在肌原纤维蛋白热作用下会形成凝胶，在此过程中会导致β-折叠含量增加[27]。

图5 鸭肉制品蛋白质二级结构含量Fig. 5 Content of secondary structure of protein duck meat products

2.3 气相色谱-质谱(GC-MS)

从表1看出，植物乳杆菌发酵鸭胸肉产品的挥发性风味物质的数量以及种类有所上升。植物乳杆菌发酵鸭肉中检出10种可以挥发的味道物质，其中有酮类1种，烃类3种，醛类1种，醇类2种，过氧化物1种，胺类1种；未发酵鸭胸肉产品中可以散发的味道成分有7种，有酮类1种，烃类2种，醛类1种，醇类3种。未发酵鸭胸肉主要可以散发的味道性物质有醇、酮、烷、醛。

表1 植物乳杆菌发酵鸭肉挥发性风味物质Table 1 Lactobacillus plantarum fermentsvolatile flavor substances in duck meat

在植物乳杆菌发酵鸭胸肉产品中，胺类和过氧化物数量显著增加(p<0.05)；烃类物质增加不显著(p>0.05)，醇类物质下降不显著(p>0.05)。植物乳杆菌在发酵鸭肉时，通过鸭肉自身的酶系分解蛋白质、脂肪，生产小分子肽和脂肪酸，其为挥发性物质的前体。醛类作为中间体，能够参与氨基酸和羰基化合物的相互作用[28]。

3 结论

植物乳杆菌发酵鸭肉制品与对照组(未发酵鸭肉)相比在质地、蛋白质二级结构、挥发性物质种类等方面发生了品质变化。植物乳杆菌发酵鸭肉制品的硬度和弹性明显降低，黏性明显增加；在蛋白质二级结构中，α-螺旋含量降低，β-折叠含量增加；而且，植物乳杆菌发酵鸭肉制品的风味物质增多，尤其是醇，在数量和比例上明显增加。因此，植物乳杆菌为发酵剂生产出的发酵鸭肉制品，有良好的风味和质地，推动了发酵鸭肉制品的发展。