植物代谢组学及其在淫羊藿药材研究中的应用

靖汝楠，冯静茹，王一孝，张颜颜，李真，李莉，刘昕，张伟东

（吉林大学药学院，吉林 长春 130000）

代谢组学（metabonomics/metabolomics）通过研究生物体系（细胞、组织或生物体）在受到外界刺激后其内部小分子代谢物的动态变化，进而揭示生物体整体功能状态。代谢组学主要对生物体内代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系，是系统生物学的组成部分。其研究对象大都是相对分子质量1 000 以内的小分子物质[1]。植物代谢组学是代谢组学的一个重要分支。到目前为止，已知植物大约有30 万种。植物独特的次生代谢可产生超过20 万种次生产物，所产生的代谢物的数量有20 万～100 万种[2]。同一植物在不同环境、不同部位、不同产地或者不同的炮制方法，所得到的代谢物均有差异。这些代谢物结构迥异，数量庞大，可以使植物很好地适应环境的变化，植物类中药的次生代谢物往往是与药效相关的活性成分，也通常作为研究中药材药效学的物质基础[3]。

1 代谢组学在植物研究领域的应用

代谢组学自从兴起之后，其代谢物代表的就是终端生物信息的含义，位于生命活动调控的末端，蕴含了丰富、全面的生物标志物的信息，在生命体研究中是重要的科研工具。植物代谢组学的一般研究流程，见图1，对于收集的样本进行前处理，通过气相色谱质谱联用（GC-MS）、液相色谱质谱联用（LC-MS）及核磁共振（NMR）等技术进行成分分析，用主成分分析（PCA）、聚类分析（HCA）、偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）及正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）等方法对数据进行整合挖掘，得到生物标志物等有效信息。代谢组学在植物研究中获得了极大地进展，在解析基因功能的研究、代谢途径和网络调控机理研究、环境对植物体影响的研究和作物营养成分及质量评价这4 个方面的科研均有着极大进展。

图1 植物代谢组学的一般研究流程Fig.1 The general research process of plant metabolomics

1.1 解析基因功能的研究

基因功能的解析主要是根据生物体的表现型来追溯其基因型，从而探索其生命的奥秘，代谢组学自诞生以来为生命科学尤其是分子生物学的研究开辟了新的道路。基因的功能在其外化过程中，以代谢物的形式作为终端表现分子将其基因信息放大，从而导致其表型的改变。在对转基因植物的研究中，Ashutosh等[4]采用代谢组学与转录组学结合的方式对转基因番茄（将拟南芥的AtMYB12 转入番茄中）进行研究，发现黄酮醇生物合成增多，可能机制是转基因番茄中的苯丙氨酸途径基因（参与黄醇酮的生物合成）表达上调。Mohammed等[5]在深蓝鼠尾草萜类生物合成关键基因的探索中，将其中的3 个高表达转录本基因SgFPPS、SgGPPS和Sg LINS 在拟南芥中过表达，从而证实了这些基因参与萜烯生物合成。

1.2 代谢途径和网络调控机理的研究

生命体的秘密始终是一个神奇的存在，有太多的未解之谜等待我们去解决，植物体的代谢途径和代谢网络就是其中的一个例子，其精密而微细的调节机理是科研工作者攻破的关键点。在对调节网络的探索中，Tan 等[6]利用UHPLC-Q-TOF-MS 和RNA-seq 技术对不同发育阶段的番红花柱头类胡萝卜素生物合成进行研究，先确定其合成过程中的关键基因和转录因子，再通过转录组学与代谢组学结合的方法分析，发现类胡萝卜素合成的新的分支途径。杨杰等[7]在对当归的研究中对比发现，当归头和尾具有不同的代谢通路，与类苯基丙烷生物合成通路相关的代谢物有13 个，如咖啡酸、香草醛和阿魏酸等。Rios-Estepa等[8]借助动态数学模型，对胡椒薄荷中的单萜类挥发油的积累过程进行了复现。

1.3 环境对植物体影响的研究

植物当中的农作物与人类的生产和生活息息相关，科研工作者对农作物的产量、性状优良与否等的大量关注，使农作物的科研获得了可喜的进步。当重金属过量时，威胁植物正常代谢，其途径主要是通过置换蛋白质离子、产生活性氧自由基和与植物蛋白质反应等3 种方式应激[9]。植物受到温度胁迫时，植物体内的氨基酸、三羧酸循环的中间代谢物和碳水化合物的含量都会有所波动[10]。在研究病原真菌对植物胁迫的影响时发现，由病原真菌稻瘟菌引起的稻瘟病，其酚类、类苯基丙烷积累可能的原因是当病原侵入水稻体内时，过氧化物酶的活性增强，加速了木质素和软木质的合成，使得细胞壁增厚，进而引起酚类合成的减少[11]。

截至目前，对植物的生态代谢组学的研究还仅仅停留在实验室层面，在具体的现实环境中的影响因素众多，无法控制单一的变量，因此在具体植物培养时，其操作性不强[12]。

1.4 作物营养价值及质量评价

植物在人类生存发展中分量极重，无论是粮食、蔬菜和水果，还是天然药物等，其营养成分及安全性评价关乎人们的身体健康，它们的重要性不可忽视。Sun等[13]对芥蓝中的芥子油含量进行了生长全程的监控，发现在芽苗菜时期芥子油的含量达到了最大值。自从转基因食品进入人们餐桌以来，饱受争议，代谢组学在转基因食品安全方面有一定的研究。Carrarif 等[14]通过实验验证了转基因番茄与正常番茄之间在代谢水平上没有明显的物质差异。

1.5 植物代谢组学的前进阻力和未来展望

植物代谢组学仍处于快速发展的阶段，其前景光明。2002 年4 月在荷兰举行的世界上第一届植物代谢组学大会为促进其日后的发展奠定了坚实的基础[15]。但是代谢组学作为一个新兴的交叉学科，涉及的不仅仅包括生物化学和分析化学，还有化学计量学等学科，对学科的综合性要求较高。在其发展过程中必定会遇到各种各样的困难和阻挠，首先影响最大的是分析手段的限制性，无论是气质联用，还是液质联用，在检测灵敏度、仪器精密度和实验耗费时间过长等方面，都无法满足日益增长的实验需求；其次是数据分析方法不够高效和便捷，每次的代谢组学实验都产生海量的数据，数据处理任务繁重复杂，急需更便捷的数据分析方法的出现，以减轻科研人员的巨大工作量；还有数据库数量较少，覆盖面不广，没有将科学实验成果进行高效、合理地富集，导致获取最新信息的途径曲折，极大地阻碍了科研前进的步伐。所有研究者都期待着自动化、标准化和完整化的代谢组学研究技术的面世[16]。相信随着科技的发展，问题会逐渐得到解决。我们依然对植物代谢组学的发展持有乐观态度，认为植物代谢组学处于快速发展阶段。在未来生物发展中将会逐步体现出代谢组学独有的优势，代谢组学为生命科学的研究打开了一扇新的窗口。从整体层面开展科学研究，将会有新的突破，主要表现在以下的几个方面：一是多种组学技术结合，为从基因到代谢物的整个过程的揭秘提供了可能，尤其是对非模式的药用植物（人参、红豆杉和长春花等）进行组学研究；二是根据代谢组学与中医药整体观的一致性，充分发掘其潜在联系，更好地研究中医药与人体的相互作用机制，具体就是通过绘制中药制剂在人体代谢途径的网络图并与正常代谢图谱比较，找出其代谢途径和作用机制[17]。

2 植物代谢组学在淫羊藿研究中的进展

植物药是传统中药种类最多、应用最广的一类中药。植物代谢组学利用代谢组学的分析方法，研究种属、生长环境以及炮制等因素对药材代谢产物的影响规律。淫羊藿作为传统的常用中药材，同属植物种类多，生长栽培分布广，有效成分复杂。本文对植物代谢组学在淫羊藿药材栽培生长、炮制工艺、基源鉴定、品质控制以及药理作用等方面进行综述。

2.1 代谢组学在淫羊藿栽培生长中的应用

药材的栽培方法对其品质优劣有着直接的影响，淫羊藿生长过程代谢物轮廓的检测分析，对于确定淫羊藿的合理采收时间和适宜生长环境具有重要的指导意义。众多的植物学家和天然药物工作者在此方面投入了巨大的精力。Qin 等[18]采用UPLC-ESI-MS/MS 技术，在4个生长阶段对柔毛淫羊藿叶片的代谢物组成进行了靶向代谢组学分析，阐明了淫羊藿叶成分特别是黄酮类化合物在开花后的含量变化规律。多数黄酮类化合物、单宁类化合物、木脂素类化合物和香豆素类化合物含量均随淫羊藿的生长成熟而增加。Pan 等[19]研究了光照强度对淫羊藿药材的影响，在54.6～90.9mol m-1s-1的光照强度下，淫羊藿总黄酮成分含量较高，且部分主要成分含量对光照的反应表现出差异。李小明等[20]对不同光照强度和不同颜色光照下的巫山淫羊藿中的黄酮类化学成分含量进行了研究，发现弱光且黄光照射时淫羊藿苷类黄酮含量较高，弱光条件下黄光能显著增加茎枝萌发，在生产淫羊藿过程中，可以根据光的强弱并改变合适的光的颜色来提高生物量和黄酮类含量。淫羊藿在我国多地均有种植，但是海拔的高低对其生长也有一定的影响。秦伟瀚等[21]通过UPLC-MS/MS法对不同品种的淫羊藿黄酮的含量进行研究，发现不同海拔其黄酮含量有所不同，随着海拔逐渐升高，其黄酮含量逐渐降低。张云风等[22]通过水培法对氮素在巫山淫羊藿黄酮含量的影响进行了分析比较，指出巫山淫羊藿属于高氮耐受性植物，当硝态氮与铵态氮混合施用，配比为2.5 mmol L-1硝态氮与2.5 mmol L-1铵态氮时，效果最好。周涛等[23]对野生粗毛淫羊藿进行了全面细致地研究，指出其淫羊藿总苷在生长期和繁殖期没有显著差异。这些研究进展将为更好地培育淫羊藿提供了思路。

2.2 代谢组学在淫羊藿炮制工艺中的应用

为了增强药效，减除毒性甚至改变药性，中草药原料材往往需要炮制加工。淫羊藿炮制方法较多，药典记载的饮片炮制方法为干燥和羊脂油炒炙，此外还有酒炙和热加工等。炮制对淫羊藿的质量品质有着重要的影响，药材的功效也和炮制方法息息相关，临床研究发现淫羊藿生品侧重于祛风湿而炙品侧重于补肾阳[24]。中药炮制过程使药材组分结构产生变化，应用代谢组学的研究方法，探究炮制前后的成分差异，可以为淫羊藿的炮制阐明理论基础。Zhang 等[25]优化了淫羊藿热加工工艺，采用LC-MS/MS 对5 种基源13 批次淫羊藿原料和炮制品的质量进行了评价。对分析的16 种化合物PLS-DA 分类结果表明，生品和炮制品差异贡献最大的成分是淫羊藿次苷I、宝藿苷II、槲皮素、淫羊藿苷和箭藿苷B，为进一步优化淫羊藿炮制工艺条件提供了新的指标观点。Jian 等[26]测定淫羊藿不同部位及炮制品中有效成分的含量，结果表明，叶中淫羊藿苷和朝藿定C 的含量高于其他部位，这些成分在根中的含量与叶中的含量相近。淫羊藿各部位淫羊藿苷和朝藿定C 经加工后均减少，炮制过程中应注意火候，温度不宜过高，以免对药用成分造成损害。Zhao[27]研究了干燥工艺对黄酮类化合物含量和抗氧化活性的影响，共鉴定出27 种化合物，并对其中11 种化合物进行了进一步定量，8 种戊烯基黄酮在不同干燥过程中含量变化显著，其中以淫羊藿苷和宝藿苷I 含量变化最为明显；体外抗氧化实验表明活性的变化趋势与总黄酮、afzelin和淫羊藿苷的含量呈正相关。李明雨等[28]应用UPLC-Q/TOF-MS 技术建立生、炙淫羊藿指纹图谱，对其全成分进行分析并找出标志性化学成分，根据OPLS-DA 整体探究9 个不同产地、不同批次的淫羊藿炮制前后化学成分的差异，共鉴定出8-乙烯-山柰酚、淫羊藿素和淫羊藿次苷I 等9 个差异性成分，得出了炮制使淫羊藿黄酮组分总体向低糖苷转化的结论。

2.3 代谢组学在淫羊藿鉴定和品质控制中的应用

淫羊藿在《中国药典》中的收载的分类有4种，包括淫羊藿Epimediumbrevicornu、箭叶淫羊藿E.sagittatum、柔毛淫羊藿E.pubescens 和朝鲜淫羊藿E.koreanum。由于淫羊藿同属植物种类繁多，且经加工后饮片相似，导致淫羊藿的基源鉴定和质量评价成为难题。利用代谢组学的方法，对不同基源的淫羊藿进行成分分析，找出差异性成分，可以对淫羊藿的基源鉴定和质控提供新的指标依据。Qu 等[29]利用指纹图谱结合化学计量学方法鉴定多批次淫羊藿的化学标志物，实验对88 批淫羊藿进行聚类分析，将朝鲜淫羊藿和箭叶淫羊藿样品分为不同的类群，而淫羊藿和柔毛淫羊藿的样品则聚在一起，基于PLS-DA 和变量投影重要性（Variable importance in projection, VIP），共发现9 个潜在的化学标记，并与参考标准品比较或根据其MS/MS 裂解行为鉴定出6 个标记。许婷等[30]对淫羊藿的叶片、茎和叶柄3 个部位进行了代谢组学分析，结果显示这3个部位中成分种类和含量存在明显差异，叶片中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ等5种黄酮类成分均为最高，这一发现为淫羊藿的用药部位和质量的控制提供了关键的依据。秦伟瀚等[21]通过用UPLC-MS/MS 对不同产地的15 种淫羊藿进行主成分分析，结果显示淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、朝藿定A、朝藿定B 和朝藿定C 等10 种成分在各自范围内呈现良好的线性，这些样品中朝藿定C 含量最高，这种实验方法的成功为以后对淫羊藿的相关探索奠定了基础。Tie等[31]利用高分辨率质谱数据对52 份淫羊藿样品中的低聚糖进行了分析和鉴定，采用主成分分析（PCA）对52 种淫羊藿药材中检出的66 种低聚糖化合物进行了相对定量和统计处理，52 种淫羊藿药材按其低聚糖组成和含量可分为不同种类，13 个低聚糖化合物显示出作为淫羊藿属植物分类的潜在标记。Sun等[32]同时定量分析来自不同地区的5 种淫羊藿属主要类黄酮，发现不同种植物中所调查的烯丙基黄酮的总含量差异很大。淫羊藿苷和朝藿定C 为主要活性成分和质量标志，其含量差异较大。多种物质含量分析结果表明，4 种药典基源淫羊藿与巫山淫羊藿的主要成分有所不同。

中药材质量标准的建立需要完善的相关指纹图谱，淫羊藿指纹图谱亦在迅速发展。Xu 等[33]以HPLC指纹图谱分析为基础，综合应用多种分析方法，对18个峰进行分析，将19 批淫羊藿药材聚成3 类，同时对5 种生物活性成分进行了定量测定，这些方法成功地用于淫羊藿样品的地理来源鉴定和质量评价。尹艳微等[34]采用UPLC 建立了淫羊藿药材的指纹图谱分析方法，在该研究中发现不同批次的淫羊藿在谱图上有21 个共同的峰，其中只有6 个峰的化合物是已知的，分别为木兰花碱、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝藿苷I，但是这些谱图的相似度极高，因此可以用来进行质量评价。牛晓静等[35]针对淫羊藿中的黄酮类成分建立了UPLC 指纹图谱，结果显示即使在不同产地，淫羊藿黄酮成分的图谱相似度也极高，足以进行质量的控制评定。王悦云等[36]就贵州不同产地的粗毛淫羊藿建立HPLC 指纹图谱，并且结合PCA 和聚类分析方法，建立了共有图谱，共有峰20 个。淫羊藿指纹图谱的研究，为全面了解各地淫羊藿所具特征提供了强有力的工具，使得淫羊藿的质量控制更为规范。

2.4 代谢组学在淫羊藿药理活性研究中的应用

淫羊藿的药理作用研究比较广泛，人们已采用代谢组学方法研究淫羊藿在肾阳虚、骨质疏松、抗疲劳以及抗衰老等方面的作用机制，本文综述了淫羊藿的药理活性。在第八次全国药物与化学异物代谢学术会议上，鹿秀梅等[37]以淫羊藿有效成分为物质基础，利用组学策略指明了淫羊藿对肾虚大鼠的异常代谢途径具有纠正作用，可使其代谢水平回到正轨。Huang 等[38]基于UPLC-MS 的主成分分析代谢组学策略，研究了淫羊藿对肾阳虚证大鼠代谢的影响。在肾阳虚证大鼠中观察到明显的代谢紊乱，并确定了16 个潜在的生物标志物，涉及氧化-抗氧化平衡、氨基酸代谢和脂质代谢，淫羊藿对这些代谢紊乱具有时间依赖性的恢复作用。侯健等[39]采用GC-MS 和NMR 相结合的方式，通过主成分分析，研究不同炮制淫羊藿对肾阳虚证调节作用，结果表明，炙淫羊藿对肾阳虚证的干预效果最强，为其温肾助阳作用作出了体层面的解释。

淫羊藿具有“强筋骨”的保健作用，现代组学技术的应用，可以为其作用机制阐明分子基础。Pan等[40]系统地分析了糖皮质激素性骨质疏松症（GIO）大鼠的代谢组学特点，并结合多元数据分析，阐明淫羊藿对其治疗作用。淫羊藿对骨质疏松症有显著的防治作用，可逆转GIO大鼠多种代谢途径的改变，包括能量、脂质、氨基酸和磷脂代谢以及肠道菌群紊乱。Xue 等[41]从系统生物学的角度，将蛋白质组学和核磁共振代谢组学相结合，从蛋白质和代谢产物的水平全面探究了淫羊藿苷抗骨质疏松作用的信号通路。淫羊藿使去势骨质疏松小鼠中23 种蛋白和血清8 种代谢产物发生了明显的变化，涉及骨重建、能量代谢、细胞骨架、脂质代谢和MAPK 信号等，淫羊藿可以通过多靶点多通路对骨质疏松的病程进展产生干预作用。

淫羊藿在延缓衰老方面也有其特有的功效，Wu等[42]采用转录组学和代谢组学的方法研究淫羊藿总黄酮的抗衰老作用。代谢组学研究中发现了24 种与衰老相关的代谢物，包括棕榈酰胺、亚油酸和油酰胺等。转录组学和代谢组学结果的综合数据分析表明，12条关键代谢途径参与其中，其中一半与脂质代谢高度相关。黄建华等[43]用组学的方法对血清中的代谢物进行检测，结果显示有199 个基因与年龄相关性极大，淫羊藿苷可以对部分基因的表达实现逆转，从而使人呈现年轻化。沈琮[44]在对抗衰老机制研究中指出，淫羊藿苷预防细胞衰老的作用机制是通过降低活性氧ROS 的水平实现的，进而使p53 的表达减少，表现出抗氧化的作用。淫羊藿中的多糖成分（HEP）对疲劳缓解有作用，池爱平等[45]对淫羊藿多糖成分改善大鼠慢性疲劳（CFS）的作用以及代谢机制展开研究，采用代谢组学技术对大鼠尿液进行GC-MS 检测，对各组之间的差异代谢物及其代谢通路进行分析，结果表明，HEP 主要通过改善CFS 大鼠体内的下丘脑-垂体-肾上腺轴功能异常和调节精氨酸、脯氨酸代谢2 条代谢途径治疗CFS。

综上所述，代谢组学是研究中医证候理论精髓和中药作用机制的一个很有潜力的工具，可为中医药的安全性和有效性提供科学合理的信息。相信随着分析手段和相应数据库的开发，对淫羊藿的研究将会登上新的台阶。

3 小结与展望

近年来，代谢组学处于蓬勃发展的阶段，气质联用、液质联用等仪器的使用范围逐渐广泛，同时，数据分析处理技术也日益成熟，对于复杂代谢物的分析能力也逐渐增强，尤其是在中药的分析中。由于中药成分十分复杂，对疾病的治疗难以实现一对一精准治疗，因此，对复杂的中药治疗进行代谢组学的分析显得尤为重要。代谢组学在植物研究领域中有着举足轻重的作用，尤其是与基因组学、转录组学和蛋白质组学技术相结合应用时，可以更好地实现代谢组学对于复杂化合物的分析，更好地建立起从基因到代谢物完整的代谢网络。

植物的代谢物种类多样、性质多变且在体内各组织分布的特异性，导致对其进行分离分析较为困难，因此寻找强大的分析检测工具为重中之重。近年来，随着代谢组学的发展，越来越多的检测技术趋于完善，不同的分析手段对于不同的代谢物也有了更大的检测能力，同时多种分析设备的联合使用使得分析效率大大提高，可为中药材的鉴定、鉴别及炮制方法的检验提供技术保障，植物代谢组学方法可为中草药的研究开辟新思路。

淫羊藿是著名的传统中药，许多中药组方中都可见其身影。目前，利用植物代谢组学方法主要解决的问题集中在品种鉴别、完整代谢轮廓的分析、质量安全标准的建立和有效成分的作用机制等方面。但是，目前尚无相关文献介绍如何利用代谢组学的方法进行分类鉴别；对淫羊藿生长过程中的代谢轮廓分析，是围绕其不同产地的不同光照强度、海拔和水培法等角度进行的代谢物差异的对比分析；科研工作者也积极建立淫羊藿的中药指纹图谱，共有峰达到21 个，且不同样品组之间相似度满足要求，为之后的研究奠定了基础；淫羊藿中成分众多且复杂，大多研究是围绕总黄酮、多糖等成分开展，并取得了一定进展，但依旧存在研究盲点，需要科研工作者继续努力攻克。相信随着GC-MS、LCMS 和CE-MS 等技术的发展，数据处理手段的成熟以及相关软件的开发，会极大地推动植物代谢组学的发展，使其具有广阔的应用前景。尤其在中医药领域，这一整套的分析手段，为科学阐释提供了工具，从整体性角度进一步挖掘了作用机制，能更好地完善对淫羊藿的研究。

植物代谢组学正处于迅猛发展的阶段，其在揭示植物的生长发育以及适应不同体内环境的分子机制中发挥着越来越重要的作用。目前，在代谢物分析技术、化合物的结构鉴定以及数据的分析等方面仍然存在着技术瓶颈，同时也面临着多种挑战，这些瓶颈和挑战激励着植物代谢组学研究者去探索解决方法。