不同加工工艺对刺梨叶茶品质和化学成分的影响

张宝会，姚新转，陈湖芳，张传明，吕立堂,※

（1.贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院山地植物资源与种质创新省部共建教育部重点实验室，贵州 贵阳 5500251；2.贵州大学茶学院，贵州 贵阳 550025；）

刺梨具有很高的营养价值。它富含山梨素、维生素C、多酚、多糖和-谷甾醇等物质，其中所含维生素C为27 040 mg/kg[1]，被称为“维生素C 之王”。前期研究发现，刺梨具有多种生理功能：山梨素具有消化、健脾、收敛和止泻的作用，主要用于治疗腹胀和腹泻等疾病；黄昌娥等[2]研究刺梨提取物可在体外抗肝癌细胞增殖，对肝癌有一定抑制作用；王辉等[3]发现刺梨干粉可以调节肾功能并延缓肾功能衰竭；王慧等[4]研究了刺梨中砷的吸附机理；李俊等[5]发现刺梨粉具有解毒作用；杨江涛等[6]发现刺梨花可以提高小鼠的抗氧化能力并延缓衰老。由于刺梨的各种作用，其果实的研究已经广泛开展。目前市场上有刺梨干果、刺梨酒、刺梨饮料、刺梨果粉、刺梨蜜饯和刺梨软糖等产品，价格便宜，营养丰富，易于保存，并有良好的市场反应。

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.F. normalisRehd. Et Wils.）是多年生的落叶乔木蔷薇科灌木[7]，广泛分布在中国西南地区，如贵州、广西、湖南、四川和重庆。刺梨果是可食用的，长期以来一直被用作传统中草药[8]，因此，作为贵州独特的植物资源一直是贵州保健食品研究领域的热点，但刺梨幼叶未得到合理地应用，主要因为其幼叶很难采摘，且产量很小。刺梨幼叶通过茶的加工工艺制成的刺梨叶茶，由于其独特的茶香气和保健功效，在当地市场上供不应求。然而，关于刺梨叶茶研究的报道很少，因此，本实验以刺梨鲜叶为原料，研究不同加工工艺对刺梨叶茶的品质、主要营养成分和抗氧化活性的影响，对将来在保健饮料、营养食品和化妆品行业中使用刺梨叶开发功能性产品具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

2019 年6 月15 日，在贵州省贵阳市龙里县的“刺梨沟”种植基地采摘刺梨的新芽。它们由1 芽、1 芽1叶、1 芽2 叶和少量的1 芽3 叶组成。所用标准品没食子酸（CAS号：149-91-7）、野蔷薇苷（CAS号：88515-58-6）、胡萝卜苷（CAS号：474-58-8）、芦丁（CAS号：153-18-4）及试剂1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）均购自上海源叶生物技术有限公司（中国上海），所有标准品均为色谱纯，其他试剂为分析纯。

1.2 方法

将刺梨鲜叶均匀地摊放在竹席上，采用3 种制茶加工工艺对刺梨鲜叶进行加工，它们的投叶量都是10 kg，具体方法如下：

刺梨叶绿茶加工分为:1）微波杀青（中国格兰仕集团有限公司微波炉型号：WP700P21）：杀青1 min、揉捻20 min、干燥60 ℃12 h；2）滚筒杀青（浙江上洋机械有限公司型号：6CST-40）：滚筒温度360℃，杀青45 s、揉捻15 min、干燥60 ℃12 h；3）蒸汽杀青（苏泊尔不锈钢蒸锅）：杀青2.5 min、揉捻15 min、干燥60 ℃12 h。

刺梨叶红茶加工：萎凋15 h、揉捻15 min、发酵3.5h，将发酵后的叶子（约1 cm 厚）铺在干燥机（浙江绿峰机械有限公司，瞿州，6CZG-60）的干燥盘上，最后将发酵后的叶子用80 ℃的干燥方法处理，以得到每100 g叶子中约含5 g 水分的红茶[9]。

刺梨叶白茶加工：采摘鲜叶用竹匾及时摊放，厚度均匀，不可翻动。摊青后，选用室内（24±2℃）自然萎凋,当茶叶达七、八成干时，室内自然萎凋刺梨叶进行并筛。初烘烘干机温度100～120 ℃，10 min；摊凉15 min，复烘温度80～90 ℃；低温长烘70 ℃左右。茶叶干茶含水分控制在5%以内，放入冰库，温度1～5 ℃。

重复测试3 次。将一部分茶叶样品保存下来，将另一部分研磨并通过孔径为0.425 mm 的筛子进行筛分，进行物理化学分析。

1.3 感官评审和主要成分分析

1.3.1 感官评审 由贵州大学茶学院的5 位评茶员（2 男，3 女）对不同的刺梨叶茶的外形、汤色、香气、滋味和叶底5 项因子进行评价并打分。计算公式为：感官得分=外形（25%）+汤色（10%）+香气（25%）+滋味（30%）＋叶底（10%）[10]。茶样品用随机数盲编码，将干茶放入专门的白板中以评估干茶的外形等，用新鲜煮沸的纯净水分别向标准的评审碗中注入水提取茶样品（3 g）5 min。小组成员被要求闻及品茶水等，并在样品之间暂停30s[11]。红茶、绿茶和白茶的感官特性的定义和等级参考国家标准[12]。

1.3.2 抗坏血酸含量的测定 称量100 g代表性样品的可食用部分，放入组织捣碎器中，加入100 mL提取剂，然后迅速捣碎成匀浆，称量10～40 g 浆液样品，将样品转移到带有萃取剂的100 mL 容量瓶中，稀释至刻度，摇匀并过滤，按中华人民共和国国家标准（GB 6185-6186-2016）[13]测定。

1.3.3 氨基酸含量的测定 称取10 g 过筛（100 目）粉末，吸取1 mL 样品提取物和1 mL L-1谷氨酸标准溶液分别加入到10 mL试管中，然后分别加入0.5 mL磷酸盐缓冲液（pH 8.0）和2%0.5 mL L-1的茚三酮溶液，将试管在沸水浴中放置10 min，然后立即在冰浴中冷却至室温，定容至25 mL，放置10 min，用分光光度计在570 nm 下测量样品的吸光度，以试剂空白溶液做参照，用标准品吸光度绘制标准曲线，计算方式参考中华人民共和国国家标准（GB/T 8314-2013）[14]。

1.3.4 总黄酮含量测定 精密称取4 g 干茶过筛（100目）粉末，置于150 mL 具塞锥形瓶，加适量甲醇溶液提取，每次提取30 min，共2次，滤过，滤液置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，通过微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液参考中华人民共和国国家标准（GB/T 20574-2006）[15]。

1.3.5 高效液相色谱检测 刺梨叶茶中芦丁、野蔷薇苷、没食子酸及胡萝卜苷的含量。

（1）样品提取方案：

（a）取样品约0.5 g，加入色谱级甲醇2.5 mL，涡旋震荡1 min。

（b）4 ℃，水浴超声30 min，4 ℃，10 000 g 离心1 min，取上清液。

（c）沉淀再次加入色谱级甲醇2.5 mL，重新提取1 次。

（d）4 ℃，10 000 g 离心1 min，取上清液，合并两次上清液。

（2）HPLC-MS/MS 方法

液相条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C8 反相色谱柱（2.1150,3.5m）。

柱温：35 ℃。

流动相：A：0.1%甲酸；B：乙腈。

流速：0.3 mL min-1。

表1 液相梯度参数Table 1 Gradient Parameters of HPLC

仪器所测得浓度为最终提取液的浓度，经计算获得原样品中物质含量，计算方法如下：

物质含量（ng g-1）=检测浓度（ng mL-1）稀释体积（mL）/称取质量（g）

其中稀释体积为样品最终溶解进样时所用的溶液体积，称取质量为提取时的取样质量。检测浓度由待测物质峰面积代入标曲方程，由仪器自动求得。

1.4 自由基活性清除

1.5 数据分析

所有实验数据均由独立的3 次重复试验计算得出，标为均值±标准差。使用单向方差分析（ANOVA）分析结果。Fisher 最小显著差异（LSD）检验用于评估均值差异，P ＜0.05 被认为是显著的。所有统计分析均使用SPSS 统计软件（SPSS，美国伊利诺伊州芝加哥市）进行。

2 实验结果与分析

2.1 不同加工方法对刺梨叶茶感官品质的影响

对不同的加工工艺的刺梨叶茶进行了感官审评，结果表明，制成的刺梨叶茶的感官品质，不同的加工方式存在较大差异，见表1。刺梨叶制成的红茶总评分最高，颜色红明亮，有花果香气，冲泡的茶汤滋味醇厚鲜爽，综合品质分析，刺梨幼嫩鲜叶可用于制作高品质的红茶。微波杀青刺梨叶绿茶颜色嫩绿明亮，但冲泡茶汤的香气稍显不足；绿茶蒸汽杀青和绿茶滚筒杀青茶叶汤色深黄色或黄绿欠亮，香气不足。刺梨白茶颜色尚绿明亮，汤色欠明亮，香气清香，滋味鲜爽，叶底软嫩欠明亮，匀整。结果分析可知，刺梨鲜叶适合制红茶，其次是微波杀青绿茶。

图1 刺梨叶茶样品Fig.1leaves tea sample

表1 不同加工方法刺梨叶茶样品的感官质量得分Table 1 Sensory quality scores ofleaves tea samples with different processing methods

表1 不同加工方法刺梨叶茶样品的感官质量得分Table 1 Sensory quality scores ofleaves tea samples with different processing methods

注：括号里的数值表示该项评分占总分的比例，同一列中‘*’表示差异达到显著水平（P ＜0.05）。Note:The value in brackets indicates the proportion of the score in the tatal score,‘*’in the same column means the difference has reached a significant level(P ＜0.05).

序号Code叶底（10%）Leaf bottom 总分Total score评语 得分Comments score外形（25%）Appearance香气（25%）Aroma汤色（10%）Liquor color滋味（30%）Taste评语 得分Comments score评语 得分Comments score评语 得分Comments score评语 得分Comments score刺梨叶绿茶微波杀青Rosa roxbunghii leaves green tea microwave wrap刺梨叶绿茶滚筒杀青Rosa roxbunghii leaves green tea tumbler wrap刺梨叶绿茶蒸汽杀青Rosa roxbunghii leaves green tea steam wrap刺梨叶红茶Rosa roxbunghii leaves black tea嫩绿90±0.5 Verdant嫩绿87±1.5 Verdant嫩绿85±1.9 Verdant乌黑油润，紧结93±1.2*Jet black oily,tight knot尚高爽89±1.2 Still Fresh清香88±0.6 Fragrant清香82±1.5 Fragrant嫩香85±1.3 Tender fragrance绿明亮88±1.8 Bright green绿明亮84±1.3 Bright green绿明亮83±3.1 Bright green红明亮90±2.7 Bright red鲜醇88±0.6 Fresh alcohol清爽88±0.17 Refreshing清爽86±1.8 Refreshing鲜醇91±0.3*Fresh alcohol匀齐86±0.6 Evenly 88±0.94匀齐86±0.12 Evenly 86.6±0.74匀齐87±2.0 Evenly 84.6±2.06细嫩92±0.7*Tender 90.2±1.24刺梨叶白茶Rosa roxbunghii leaves white tea尚匀整83±0.9 Still neat清香83±0.8 Fragrant尚绿黄85±2.5 Still green yellow醇厚87±2.4 Mellow尚灰绿明亮84±0.9 Grayish green and bright 84.4±1.5

2.2 不同的加工方法对刺梨叶茶中抗坏血酸、氨基酸和黄酮含量的影响

本研究结果发现，刺梨叶绿茶和刺梨叶红茶的维生素C 含量低于刺梨叶白茶，可能是因为绿茶杀青高温和红茶发酵过程中维生素C 降解速度比白茶快（图2 A）；刺梨叶茶中不同加工方式氨基酸的含量，刺梨叶微波杀青绿茶含量最高28.8 mg/g，其次是白茶25.9 mg/g（图2 B）。刺梨叶中含有生物活性物质黄酮类化合物的含量，白茶＞红茶＞蒸汽杀青绿茶（图2 C）。

图2 不同刺梨叶茶中抗坏血酸、氨基酸和黄酮的含量Fig.2 The contents of ascorbic acid,amino acids and flavonoids in different Rosa roxbimghi leaves tea

2.3 不同的加工方法对刺梨叶茶中野蔷薇苷、没食子酸、胡萝卜苷和芦丁含量的影响

本实验采用HPLC-MS/MS 对刺梨叶茶中野蔷薇苷、没食子酸、胡萝卜苷和芦丁含量进行测定，结果见图3，野蔷薇苷含量在刺梨叶绿茶和刺梨叶白茶中比刺梨叶红茶中高，差异极显著，绿茶中野蔷薇苷含量是红茶的3.8倍，白茶是红茶的3.2 倍（图3A）；没食子酸在红茶中含量是54758.09ng/g，在微波杀青绿茶中是15 484.1 ng/g，在白茶中是31 045.49 ng/g（图3 B）；胡萝卜苷在红茶中含量是1 104.04 ng/g，在微波杀青绿茶中是244.32 ng/g，在白茶中是804.81 ng/g（图3 C）；芦丁含量在红茶中是650.3ng/g，在微波杀青绿茶中是408.38 ng/g，在白茶中是506.11 ng/g（图3 D），分析结果可知，不同的处理方式对刺梨叶茶中化学成分含量具有一定的影响，但是化学成分在刺梨叶红茶中的含量比刺梨叶绿茶中的含量稳定。

图3 不同刺梨叶茶中野蔷薇苷、没食子酸、胡萝卜苷和芦丁的含量Fig.3 The content of rosamultin,gallic acid,carotin and rutin in different leaves tea

2.4 不同的加工方法对清除DPPH自由基能力的测定

分别提取刺梨叶茶中的黄酮和维生素C，黄酮和维生素C 对DPPH 均具有一定的清除能力，但是刺梨叶茶总黄酮的DPPH 清除能力小于维生素C。不同加工方式刺梨叶茶中黄酮的DPPH 清除率：红茶（76.16%）＞微波杀青绿茶（75.86%）＞白茶（75.57%）＞蒸汽杀青绿茶（71.67%）＞滚筒杀青绿茶（71.58%）；不同加工方式刺梨叶茶中维生素C 的DPPH 清除率：红茶（91.16%）＞微波杀青绿茶（90.19%）＞白茶（89.90%）＞蒸汽杀青绿茶（81.67%）＞滚筒杀青绿茶（81.58%）。研究表明黄酮具有较好的抗氧化性[18,19]，刺梨叶茶中的黄酮也有一定的抗氧化活性。

图4 不同加工方式刺梨茶中的黄酮和维生素C 对清除DPPH自由基能力的测定Fig.4 Determination of the ability of flavonoids and Vc in different processing methods to scavenge DPPH free radicals

3 讨论

刺梨是贵州特有植物资源，其对提高免疫功能、延缓衰老、抗氧化和降血脂等方面有明显作用。本实验首次以刺梨鲜叶为原料，通过不同的加工方式加工成绿茶、红茶和白茶，并对这些茶进行感官评审及综合评分，结果表明，刺梨鲜叶适制红茶（颜色红明亮，有花果香，冲泡的茶汤滋味醇厚鲜爽）。刺梨被称为“维C 之王”，特别是刺梨富含的超氧化物歧化酶（简称SOD），是具有抗衰、防癌作用的活性物质；此外还具有抗病毒、抗辐射的作用，在心血管、消化系统和各种肿瘤疾病防治方面，应用十分广泛。结果可知刺梨叶绿茶和刺梨叶红茶维C 含量低于刺梨叶白茶，可能是绿茶高温杀青和红茶发酵过程中维生素C 降解。氨基酸是刺梨叶茶中最重要的化学成分之一，是新鲜，轻快的口感的主要成分之一，是形成香气的基础[11]，刺梨叶茶中不同加工方式氨基酸的含量，刺梨叶绿茶微波杀青含量最高28.8 mg/g，其次是白茶25.9 mg/g。刺梨中含有生物活性物质黄酮类化合物，具有消炎、扩张冠状动脉、影响血压、保护心血管、清除自由基和抗肿瘤等重要生物活性[20]。刺梨叶白茶黄酮类含量最高，但DPPH 清除能力低于刺梨叶红茶，可能是在测定黄酮过程中出现的实验误差或者是红茶中还有其他物质也参与了自由基清除。野蔷薇苷是发挥抗缺氧作用的主要活性成分[21,22]，具有肝保护作用[23]，此外野蔷薇苷还具有抗HIV、抗氧化应激等作用[24-26]，结果显示，不同的制茶工艺对野蔷薇苷含量具有一定的影响，在绿茶中野蔷薇苷含量最高，其次是白茶和红茶。同时，对刺梨叶茶中没食子酸、胡萝卜苷和芦丁进行测定，结果发现，这3 种物质在红茶中含量最高且差异显著，其次是白茶和绿茶，差异不显著，红茶发酵很大程度上取决于叶内氧化酶活性的强弱[27]，使叶内化学成分发生了变化。综合茶叶感官审评结果和茶叶主要品质成分分析，刺梨鲜叶适制红茶。

本实验对不同刺梨叶茶的黄酮进行了DPPH 清除能力测定，并以维生素C 为对照，初步评价了其抗氧化活性：红茶（76.16%）＞绿茶微波杀青（75.86%）＞白茶（75.57%）＞绿茶蒸汽茶青（71.67%）＞绿茶滚筒杀青（71.58%），也为今后深入对其降糖、降脂和降压等药理研究提供了基础[28]，为贵州特有野生资源刺梨叶茶的研究与开发提供了一定的科学参考依据。