白念珠菌生物膜相关基因对耐药性的影响

郭晓宇 李小静

(1.河北工程大学临床医学院，邯郸 056002；2.河北工程大学附属医院皮肤科，邯郸 056002)

念珠菌属于人体正常生物菌群，可寄居于人的口腔、皮肤、阴道等部位。当宿主免疫功能缺陷及致病菌毒力增强，白念珠菌可能引起浅部或深部真菌感染。生物膜形成能力是白念珠菌一种重要的致病毒力因子。成熟生物膜具有超强黏附力和复杂的自身结构，可黏附于植入式的医疗器械上，阻止了抗菌药物的渗透，逃避机体的免疫杀伤作用，促进生物膜再生成，不仅为真菌的持续感染提供条件，同时在真菌耐药性中发挥重要作用，这为真菌感染治疗带来重大挑战。目前对于白念珠菌生物膜研究更为细致，通过对生物膜结构合成相关基因调控和耐药性发挥的研究进展进行归纳，可对真菌生物膜致病、耐药机制有更进一步的认识。

1 生物膜的组成结构

真菌生物被膜(biofilm)是由细胞外基质包裹着的，含有孢子、菌丝和假菌丝3种细胞形态的高度致密三维网状系统，利于细胞与介质间相互黏着。其形成过程大致分4个阶段：早期酵母细胞以芽孢的形式黏附形成单层结构；中期在胞外聚合物作用下，浮游真菌细胞黏合形成基底层；成熟期细胞外基质的不断积累将真菌3种形态细胞完全包裹，最终发育为成熟的生物膜[1]。最后一步，成熟的生物膜发生解离，酵母细胞脱落释放，表现出更高的黏附力，游离并附着于周围物体表面进而形成新的生物膜[2]。生物膜结构中含有的核酸、金属离子、脂质等物质相互作用，使生物膜细胞间连接更加紧密。黏附、生长、成熟、释放、再生，这是一个连续不断的过程。

2 生物膜形成相关基因及耐药性

白念珠菌的生物膜形成过程错综复杂，黏附及菌丝的延伸、胞外基质产生，以及成熟后生物膜的物质代谢、膜泵作用等环节均需多种基因调控参与完成。这些基因调控同时可能导致生物膜耐药性产生。

2.1 黏附和菌丝合成基因及耐药

白念珠菌生物膜形成的早期，为酵母细胞附着于机体黏膜或某些植入式器械上，此时黏附蛋白的高表达在真菌生物膜黏附过程中发挥重要作用。目前主要的黏附蛋白Als家族、Hwp1、Eap1、Rbt1、Ywp1是增加细胞间黏附，促进生物膜的形成不可或缺的[3-5]。研究发现，转录因子Bcr1、Snf5、Ace2 、Rob1、Tec1、Ndt80均存在于控制生物膜黏附作用的转录通路中，通过调控下游靶基因表达，正向促进黏附过程，对生物被膜形成发挥关键作用[6-7]；小部分负调控转录因子Rfx2、Sfp1、Zcf32抑制Als、Hwp家族表达，以及转录因子Gal4对生物膜新陈代谢的调节，均影响细胞间黏附，调节生物膜的形成[10-12]。此外，MAPK和cAMP-PKA两条重要信号通路在黏附过程中发挥调控作用。MAPK通路中转录因子Brg1通过影响Hog1介导的Tor1激酶，抑制黏附基因ALS1、ALS3和HWP1表达[8]； cAMP-PKA通路中的靶转录因子Efg1在生物膜生长后期诱导ALS1表达[9]，促进白念珠菌生物膜黏附作用。

菌丝态可逃避吞噬，有更强的毒力和适应力，对于维持生物膜完整性和耐药性发挥不容小觑。菌丝的延伸易受到调节基因BCR1、EFG1、CPH1、HGC1、FLO8、UME6的正向作用，以及TUP1、NRG1和RFG1的负性调节[10,15-17]。信号通路MAPK和Ras1-cAMP-PKA在白念珠菌菌丝生成过程中发挥重要的促进作用。MAPK家族的Mkc1和Cek1激活转录因子Cph1，Ras1激活cAMP-PKA通路中Cyr1后诱导Efg1磷酸化，二者均在正向调控生物膜中菌丝态细胞转换，利于真菌生物膜的形成[13]。C.albicans同源基因DFG5和DCW1在生物膜形成中，通过调节Hog1 MAPK信号机制，从而促进菌丝形成，维持细胞壁结构完整性[14]。此外，真菌细胞形态转换与黏附作用密不可分。Bcr1调节ALS3和HWP1的过度表达，Efg1调控下游ALS1表达，既可调控细胞间的黏附作用，同时诱导菌丝发育而促进真菌生物膜的形成[19]。

在微生物生物膜对抗菌药物的耐药性研究中，微生物的耐药性与生物膜的黏附和菌丝形成能力有关，说明可能诱导黏附素和菌丝生成的基因均可对生物膜的耐药现象有一定影响。例如，钙调神经磷酸酶抑制剂KF506和环孢素A(CsA)通过诱导ALS3和HWP1的低表达，抑制生物膜的黏附和菌丝的生成，临床上可协同氟康唑发挥抗真菌作用[18]，提示黏附因子和菌丝生成调控基因的过度表达可能为真菌生物膜重要的耐药机制。闻轶旸等[20]研究发现，HOG1基因缺陷株对氟康唑更为敏感，表明Hog-MAPK信号通路中部分基因和蛋白表达的降低可能使耐药性发生改变。此外，Hsp90也可影响黏附蛋白基因表达和MAPK和Ras1-cAMP-PKA通路，作用于菌丝形成过程，维持细胞壁的完整性，从而发挥对常规抗真菌药的耐药性[21]。

2.2 细胞外基质(ECM)合成基因及耐药

细胞外基质(extracellular matrix, ECM)是由蛋白质、多糖、脂质、DNA组成的混合结构，可为生物膜细胞生长提供结构框架和保护作用。ECM通过辅助真菌细胞对抗宿主免疫反应，促进细胞间黏附，以及发挥屏障作用阻止或延迟药物渗入，在白念珠菌的耐药性中发挥显著作用。FKS1、BGL2、PHR1/2、XOG1在生物膜ECM中编码β-1,3-葡聚糖合成关键酶，SKN1和KRE1参与合成β-1、6-葡聚糖，SRB1编码甘露聚糖合成关键酶，这些基因特异性表达多糖合成关键酶，调控白念珠菌生物膜ECM中多糖的产生和分泌[22-25]，对ECM成熟、维持生物膜结构完整性和辅助生物膜耐药性发挥均起到重要作用。在ECM形成过程中，转录因子Zap1具有十分重要的作用。Zap1可负向调节胞外可溶性β-1,3-葡聚糖分泌，调控生物膜生成代谢过程，是调节体内生物膜ECM生成的重要成分[23]。分子伴侣Hsp90也被发现是产生基质葡聚糖所必需因子之一[28]。除分泌多糖外，细胞外基质DNA(eDNA)也是生物膜形成的重要因素之一。eDNA诱导ECM生成并贯穿生物膜生长所有阶段，破坏eDNA将影响生物膜的骨架结构，反之，添加外源性eDNA可促进增厚生物膜ECM的形成[24]。

ECM在抗真菌药物的耐药发挥中，主要通过胞外β-葡聚糖合成的关键酶与唑类抗真菌药结合，阻止药物渗入生物膜内部，而不能到达靶点发挥药物活性作用。参与此过程的主要为Fks1和Srb1通路[22,25]，诱导多糖关键酶合成参与构成ECM耐药。此外，fks1和/或fks2基因点突变，也可导致真菌对棘白菌素类抗真菌药敏感性下降[45]。在生物膜形成中晚期，SKN1和KRE1表达上调，可诱导真菌生物膜对两性霉素B耐受[26]。转录因子Zap1通过负调控于多糖生成过程中的葡糖淀粉酶(Gca1和Gca2)和乙醇脱氢酶(Adh5、Csh1和Ifd6)参与基质形成和耐药性的发挥，但并不影响Fks1调控通路[23]。细胞外基质DNA(eDNA)是生物膜产生耐药性的重要因素之一。

2.3 细胞膜甾醇代谢相关基因及耐药

在白念珠菌的细胞膜脂质成分中，游离甾醇与细胞膜结构和流动性密切相关。以麦角甾醇作用为主，通过影响麦角甾醇在细胞膜中含量和合成过程，调控生物膜耐药性。基因ERG1-27表达调控麦角甾醇合成途径中关键酶，调控生物膜中麦角甾醇的含量。

ERG11编码的麦角甾醇生物合成中靶酶羊毛甾醇14α-去甲基酶(CYP51)，促进其合成维持细胞膜的功能。CYP51是唑类抗真菌药物的结合靶点，药物可通过抑制酶活性，减少麦角甾醇合成而发挥抗真菌作用[27]。一些研究分离的白念珠菌耐药菌株中发现ERG11和编码C4甲基甾醇氧化酶的ERG25基因过度表达，产生大量的麦角甾醇合成关键酶，使唑类药物无法完全阻止酶在合成路径中发挥作用，导致白念珠菌获得耐药[29]，其中，ERG11过表达可能与其调控转录因子Upc2特定位置点突变诱导有关[27]。其他尚有研究的耐药相关基因ERG3、ERG4、ERG5、ERG6等过度表达，升高细胞膜上甾醇含量，多表现与唑类药物相关耐药性[41-42,29]。还有一些转录因子如Ndt80p、Efg1，均可调节ERG基因的表达，使菌株降低对抗真菌药物的敏感性，诱导耐药发生[39]。此外，随着生物膜逐渐成熟，麦角甾醇含量逐渐降低，影响细胞膜通透性使药物难以进入，也可促进耐药性发挥[30]。

2.4 药物外排泵合成基因及耐药

真菌生物膜上的外排泵是参与细胞物质转运的膜蛋白，主要将对细胞内有毒物质排出胞外。当膜泵发挥外排药物作用时，即表现为抗真菌药物耐药性。外排泵蛋白据其功能可分为两大类：一类是ATP结合转运蛋白(ABC)，是细胞膜上的外排机能泵，白念珠菌的耐药抵抗(CDR)基因编码的转运蛋白属于此类；另一类是易化载体蛋白超家族(MFS)，多重耐药(MDR)基因编码蛋白属于此类。ABC和MFS的高表达，可引起多种抗真菌药物的交叉耐药。

在膜泵耐药的耐药机制中，转录因子Mrr1和Tac1分别诱导下游MDR1和CDR1/CDR2基因过度表达，使外排泵活性增强，增加机体耐药性[31-32]。CDR1、CDR2表达上调促进药物外排，MDR1表达外排药物同时降低细胞膜通透性，二者联合作用降低细胞内药物浓度[33]。这三种基因表达增强是白念珠菌生物膜对唑类药物耐药的重要机制，其中CDR1对于耐药性的贡献大于其他二者[34]。Hsp90在耐药菌株中，可通过调节CDR1的高表达，发挥耐药性[21]。此外，转录因子Ndt80，有助于CDR1表达上调，还可结合于CDR2和MDR1启动子，在耐药转录机制中发挥作用[35]。若外排泵基因表达受抑制，念珠菌对唑类药物的易感性可增加4～16倍[36]。在真菌生物膜形成晚期，外排泵缺失可能会导致耐药性的降低。但研究发现CDR1、CDR2、MDR1早期表达参与唑类耐药过程，成熟期敲除全部耐药基因后，仍具有与早期相同的耐药性，考虑随着生物膜自身成熟耐药性也在逐渐增加[30]。

2.5 滞留细胞合成基因及耐药

真菌生物膜内部有一种处于休眠状态的滞留细胞，可视为酵母细胞的亚型，参与构成生物膜的高度抗药性。当生物膜被抗真菌药物攻击后，仍可留存极少滞留细胞，结合浮游酵母细胞，重新生成持续的生物亚群，致抗真菌药物失效和疾病复发，被认为是真菌生物膜耐药的重要机制。一些研究表明，滞留细胞多存在于生物膜黏附的早期阶段，黏附因子HWP1、ALS3在白念珠菌滞留细胞形成过程中表达上调[37-38]。滞留细胞的存活阶段与碳代谢过程密不可分，其中碳的主要来源为葡萄糖。研究发现，Hsp90可抑制滞留细胞中糖代谢过程，减少糖利用，为生物膜细胞再生储存能量。此外，Hsp90还可减少Ras1-cAMP- PKA通路激活，抑制凋亡反应，为生物膜的生成提供条件[40]。

滞留细胞中被检测出存在CDR、KRE1和SKN1基因过度表达，提示滞留细胞可能诱导药物外排泵的生成以及促进ECM增厚，导致生物膜耐药性增加[23,43]。Hsp90也可在滞留细胞耐药中发挥作用。高水平的Hsp90可反应出对两性霉素B的耐药性[44]。但由于滞留细胞数量极少，且不易被发现，目前与其相关的耐药机制研究并不太多。

3 小结与展望

白念珠菌生物膜形成由复杂的、多种调控因素共同参与。在生物膜形成早期黏附作用首先发挥作用，而后酵母细胞逐渐向菌丝态转化，膜内脂质的代谢和膜泵的作用，以及ECM的产生和滞留细胞存在，对生物膜耐药性的增强均有着举足轻重的作用。各个特征中基因不仅调控生物膜形成，同时也在影响生物膜耐药性的发挥。更深入地了解白念珠菌生物膜结构和相关基因调控机制，对于研发新的且更容易识别耐药性的方法和研发针对生物膜生成和耐药调控基因具有靶点作用的新型治疗干预措施非常关键。希望将来能够开发出针对白念珠菌生物膜形成和调控相关基因的理想靶点，为顽固性的白念珠菌感染治疗提供根除的希望。