抗真菌药物潜在靶点及化合物研究进展

康烨 王瑞娜 阎澜

(1.北部战区总医院药剂科, 沈阳 110016; 2.海军军医大学军特药研究中心， 上海 200433)

真菌感染在过去的几十年间增长迅速，其主要原因是现代医学的进步(器官移植和化疗)和HIV感染全球流行等原因造成易感染免疫受损人群增加[1]。目前可用的抗真菌药物主要分为唑类、多烯类、棘白菌素类、丙烯胺类和氟胞嘧啶类。这些抗真菌药物通常以麦角甾醇生物合成途径、真菌细胞膜、细胞壁或真菌DNA/RNA为靶点[2]。问题是，这些抗真菌药物在毒性、活性谱、安全性和药代动力学特性方面存在各种缺点[3]。此外，随着这些抗真菌药物的长期大规模应用，耐药率也有了显著的提高[4]。因此，寻找新的抗真菌药物，制定新的策略来对抗真菌感染是至关重要的。本文就真菌特异性或高选择性靶点及相关化合物，按照不同作用机制做一综述。

1 真菌细胞壁合成

真菌细胞壁是一个高度变化的结构，主要参与多种形态发生过程、细胞生长、胞质分裂和特殊类型真菌细胞发育[5]。真菌感染过程中，细胞壁是病原体与宿主建立联系，产生致病性和毒力的重要因素[6]。

糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白广泛存在于真菌细胞壁上，在真菌与宿主细胞的黏附中起着重要作用。肌醇酰基转移酶(Gwt1)催化GPI锚定蛋白生物合成途径的早期步骤，是manogepix(MGX,PX001A)的作用靶点[7]，该酶与最接近的哺乳动物直系同源物显示出低同源性(<30%氨基酸序列同一性)[8]。抑制Gwt1可阻止甘露糖蛋白的正确定位[9]，损害真菌细胞壁完整性，抑制生物膜产生及菌丝形成，造成严重的生长缺陷[10]。manogepix(APX001A)可抑制真菌Gwt1但对人类Gwt1同源物Pig-W没有作用[11]，这表明该化合物对真菌细胞具有选择性。fosmanogepix(APX001)是manogepix的前体药，在I期临床研究中，其口服或静脉给药均有良好的耐受性[12]，目前正在进行侵袭性念珠菌病的II期临床试验。manogepix对念珠菌属和曲霉菌的体外活性研究表明，这种新的抗真菌化合物对白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌等均具有较低的最低抑菌浓度(MIC)，对新生隐球菌也具有较高活性[1]。Gebremariam等[14]在构建中性粒细胞减少性鼠毛霉病模型中发现，给予药物fosmanogepix(104mg/kg)组的小鼠，其组织清除率及存活率与使用药物艾沙康唑硫酸酯(ISA)相当，该结果为fosmanogepix成为抗毛霉病的治疗药物提供了进一步支持。

2 线粒体功能抑制

线粒体是真核细胞的动力源，通过三羧酸循环和氧化磷酸化作用产生大部分细胞ATP库。线粒体在能量代谢中的作用包括氨基酸和磷脂的合成，磷脂与呼吸一起控制衰老、毒力和抗真菌药物耐药性等过程[15]。尽管真菌和人类的线粒体基因组具有高度相似性，但真菌特异性蛋白(如酵母Nuo1和Nuo2)有望成为选择性抗真菌制剂的开发目标[16]。

2.1 活性氧

氧化损伤内源性活性氧(ROS)是细胞代谢的副产物，主要在线粒体中产生[17]。ROS的过量产生导致细胞内严重的氧化应激，并导致核酸、脂质和蛋白质的损伤[18-19]。从紫苏及香茅属植物中提取的抗真菌天然单萜类紫苏醛、香茅醛可以引起白念珠菌中ROS的积累，从而导致白念珠菌细胞坏死，线粒体功能障碍和DNA损伤[20]。热稳定抗真菌因子HSAF(heat-stable antifungal factor)是产酶溶杆菌C3菌株的主要次级代谢产物，具有大环内酰胺结构，可通过诱导ROS的产生促使白念珠菌凋亡[21]。

2.2 T-2307

芳基胺T-2307，体外对念珠菌、曲霉和隐球菌具有杀菌活性，可预防小鼠的播散性感染[22]，该化合物由真菌细胞通过高亲和力的精胺和亚精胺转运系统摄取，可抑制整个酵母细胞和分离的酵母细胞线粒体中的呼吸链复合物III和IV，破坏线粒体膜电位[23]，但对大鼠肝线粒体功能几乎没有影响[24]，这是选择性破坏酵母线粒体功能和抗真菌活性的关键[25]。T-2307对念珠菌有很强的体内、外活性，包括耐唑类和棘白菌素类的念珠菌属、新生隐球菌等[26]。T-2307的体外活性远优于氟康唑、伏立康唑、米卡芬净和两性霉素B；对曲霉菌属的体外活性与米卡芬净和伏立康唑的活性相当[27]。

3 代谢途径

3.1 乙醛酸循环

乙醛酸循环是对三羧酸循环(TCA)的一种修改，它允许使用两种碳源，绕过TCA循环的CO2生成步骤，使碳被保留为糖异生的底物。该循环对摄取和利用不可发酵的碳源(如乙醇、脂肪酸)至关重要，使真菌细胞能够适应并在宿主营养条件有限的情况下生存[28]。

异柠檬酸裂解酶(ICL)和麦芽酸合成酶是乙醛酸循环中涉及的关键酶，其中ICL是真菌产生毒力的必需酶[29]，不存在于人类基因组中，为针对这一代谢途径的新型抗真菌药物的设计开辟了新的前景。ICL抑制剂对不同种类真菌具有高活性并对白念珠菌在巨噬细胞吞噬后的存活至关重要。宿主感染期间，病原微生物如烟曲霉、白念珠菌等可引起乙醛酸循环上调[30]。

3.2 钙调磷酸酶

真菌对棘白菌素类耐药性的产生，除FKS基因突变外，真菌细胞内的多种途径应激反应被激活也是主要原因之一，包括蛋白激酶C(PKC)、钙调磷酸酶和分子伴侣Hsp90介导的细胞壁完整性信号的激活，这对真菌适应棘白菌素类环境并引发代偿机制，如几丁质合成酶的上调至关重要[31-32]。

钙调磷酸酶调节细胞内钙稳定、细胞周期、形态转变、交配和胞质分裂[33]。抑制钙调磷酸酶信号传导是一种新策略，既能减弱真菌毒力，又能提高现有抗真菌药物的有效性，同时抑制真菌的耐药性[34]。钙调磷酸酶抑制剂FK506(他克莫司)对多种致病真菌具有活性。FK506由于具有较强的免疫抑制活性，不能作为抗真菌化合物使用，但已开发出几种具有较低细胞毒性和免疫抑制活性的FK506类似物(9D-、9DP-、31OD-、9D31OD-FK506)。除9DP-FK506外，这些类似物对烟曲霉、白念珠菌和新生隐球菌都显示出有效的抗真菌活性，而31OD-和9D31OD-FK506也与氟康唑具有协同作用。在系统性隐球菌病小鼠模型中，9D31OD-FK506与氟康唑联合应用显著延长了受感染小鼠的存活时间[35]。此外，Juvvadi等[36]用乙酰肼取代FK506的C22羰基，开发出一种FK506类似物APX879，该化合物在侵袭性真菌感染的小鼠模型中，表现出较低的免疫抑制和广谱抗真菌活性。

3.3 热休克蛋白Hsp90

Hsp90是一种重要的、高度保守的分子伴侣，可促进蛋白核糖核酸折叠、组装和成熟。Hsp90抑制剂与唑类和棘白菌素类药物联合应用对白念珠菌的抗真菌活性具有潜在的协同作用[37]。Hsp90通过其关键的下游效应器—钙调磷酸酶和MKC1激酶调节唑类耐药[38]。白念珠菌Hsp90功能受损导致生物膜对唑类耐药性消失，此外，Hsp90表达减少导致基质葡聚糖水平显著降低[39]。目前，Hsp90抑制剂因其对宿主的毒性作用，不能作为抗真菌药物使用，但Whitesell等[40]通过对白念珠菌Hsp90的核苷酸结合域(NBD)的研究，合成了对真菌Hsp90—NBD具有选择性的抑制剂，这为Hsp90抑制剂成为低细胞毒性的抗真菌药物提供了可行性。

4 表观遗传抑制

表观遗传是指在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现，包括DNA甲基化、RNA干扰、组蛋白质修饰、染色质改型。Torres-Garcia等[41]研究发现，真菌细胞可以通过改变DNA的包装方式即表观遗传变化，而非DNA序列来产生抗药性。

4.1 组蛋白乙酰化转移酶/脱乙酰基酶

真菌蛋白质乙酰化是通过在赖氨酸残基的Nε-氨基中加入乙酰基，消除该氨基酸的正电荷而发生的。这种修饰可通过影响蛋白质的催化活性、与其他蛋白质相互作用的能力或其亚细胞定位而导致蛋白质功能的改变[42]。目前鉴定出乙酰化程度最高的蛋白质组来自红色毛癣菌(23.3%)、解脂耶氏酵母(22.1%)、酿酒酵母(19.6%)、新生隐球菌(19.60%)和烟曲霉(23.90%)[43-45]。在酿酒酵母和解脂耶氏酵母这两种非致病真菌中，大多数乙酰化蛋白分别参与葡萄糖/氨基酸代谢和脂质代谢的调节[45]，而白念珠菌中乙酰化的蛋白不仅参与糖酵解和氧化磷酸化，还与组蛋白乙酰化有关，包括与白念珠菌毒力相关的H3K56ac[46]。对新生隐球菌、烟曲霉和白念珠菌的研究显示，40%的致病性相关因子被乙酰化，表明它们的功能可能受到组蛋白乙酰化转移酶的影响[43]。组蛋白乙酰化转移酶家族分为三类：GNAT(与Gcn5相关的N-乙酰基转移酶)，MYST(MOZ，Ybf2 / Sas3，Sas2，Tip60)和p300 / CBP(300 kDa蛋白和CREB结合蛋白)，其中MYST家族仅存在于真核细胞，p300 / CBP为后生动物所特有[47]。Rtt109是真菌特异性的组蛋白乙酰化转移酶[46]。

组蛋白脱乙酰基酶(histone deacetylases, HDACs)是一种去除核心组蛋白赖氨酸残基的酶，它控制基因的转录和表达并对一些非组蛋白(如Hsp90)具有调控作用[48]。MGCD290是一种抑制真菌HDACs2的新型抗真菌药物[49]，该药物以组蛋白脱乙酰基酶(HDACs)为靶点，抑制其对蛋白的脱乙酰作用，这些蛋白对真菌病原体毒力、耐药性和形态转变的调节(通常使转录和基因表达下调)起关键作用[50]。MGCD290与其他抗真菌药物如唑类、棘白菌素类具有协同作用[51]。在抗突变菌株中，MGCD290可降低MICs，恢复真菌对药物的敏感性[52]。

4.2 溴结构域(BD)

溴结构域和末端外结构域(BET)家族蛋白是与染色质相关的因子，可调节转录和染色质重塑[53-54]。BET蛋白通过其两个溴结构域(BD：BD1和BD2)与染色质结合，从而识别特定的乙酰化组蛋白[55]。研究表明，小分子抑制剂，如JQ1、I-BET和I-BET762，不仅对BET BDs具有高亲和力，而且具有高特异性[56]。这使得BET家族蛋白成为癌症、神经系统疾病、炎症等主要疾病的重要治疗靶点[55]，以此来开发可通过抑制乙酰化染色质相互作用来调节基因表达的抑制剂[57]。酿酒酵母的BET蛋白Bdf1是一种全面转录调节因子，可调节500多个基因，Bdf1的破坏导致严重的形态变化和生长缺陷。Mietton等[53]研究显示，BDF1对白念珠菌是至关重要的，其突变体表现出体外活力的丧失以及体内毒力降低。小分子抑制剂(如二苯并噻嗪酮、咪唑吡啶)可以选择性地靶向白念珠菌Bdf1中的BD1和BD2，而不会损害人的BET-BD功能。这些发现为 Bdf1 BDs抑制剂作为一类新型抗真菌药物奠定了基础。

5 毒力相关因子

5.1 铁元素

铁是多种蛋白质不可或缺的辅助因子，是真菌细胞呼吸和DNA合成等多种代谢过程的先决条件，是重要的毒力因子。真菌细胞在铁含量足够高时，定植和扩散更加明显[58]。

VL-2397(ASP2397)是从桃色顶孢霉菌中分离出的环六肽，在结构上与低分子量铁载体铁铬相似[59]。Nakamura等[60]发现，在培养基中添加0.03 mmol/L的铁可使烟曲霉的VL-2397 MIC从1增加到2 mg/L，而添加铁螯合剂BPS可将VL-2397的MIC从1降低到0.06 mg/L；这一结果表明，VL-2397的活性受铁的有效性影响。尽管其特定的细胞靶点尚不清楚，但它是由人类细胞中不存在的铁载体蛋白(Sit1)转运至真菌细胞，特别是烟曲霉，继而触发一种有效和快速的抗真菌作用，缺乏Sit1的烟曲霉细胞对VL-2397表现出抗性。此外，活细胞成像表明VL-2397可导致菌丝延长停止[61]，且与现有药物相比，它显示出快速的抑制作用(在最初的2～4 h内)和有效的体外抗菌丝伸长的杀菌活性[62]。

5.2 白念珠菌毒素

一种新发现的细胞溶解性肽毒素，念珠菌溶血素(candidalysin)，由ECE1基因(该基因是菌丝形成后表达最多的基因之一)编码，是白念珠菌重要的毒力因子，它通过破坏宿主的免疫细胞膜来对抗巨噬细胞的抗菌活性；同时，candidalysin刺激活化蛋白1(AP-1)的转录因子C-FOS(通过P38有丝分裂活化蛋白激酶MAPK)和MAPK磷酸酶MKP1(通过细胞外信号调节激酶1和2[ERK1/2]-MAPK)，触发和调节促炎细胞因子反应[63]。在致病过程中，candidalysin通过钾外排触发NLRP3炎症依赖性caspase-1激活，并作为宿主巨噬细胞和树突状细胞非炎症依赖性细胞溶解的主要促进剂[64]。这些研究表明candidalysin既作为毒力因子促进真菌的免疫逃逸，又可作为无毒力因子助力抗真菌的免疫应答[65]。

5.3 群体感应分子

群体感应分子法尼醇对生物膜的形成至关重要，当法尼醇积累到一定阈值水平，可阻碍白念珠菌酵母态向菌丝态的转变，抑制生物膜形成。此外，外源性法尼醇也可通过抑制翻译来限制酿酒酵母的生长及白念珠菌的菌丝形成[66]。Kovavs等[67]已证实，法尼醇可增强棘白素类对假丝酵母念珠菌生物膜的活性。除形态转化，法尼醇还影响酵母其他生化途径，如通过积聚活性氧来破坏基本细胞的麦角甾醇生物合成或触发凋亡途径[68]。

6 总结与展望

过去十年，真菌病原体的感染率与耐药性不断增加，但抗真菌治疗药物的进展有限，大多数最近批准或正在开发的药物是由唑类和棘白菌素的衍生物组成，致使临床抗真菌治疗仍然受到阻碍。本文所述的抗真菌药物靶点及化合物，特别是一些真菌特异性的蛋白、途径及小分子抑制剂，对哺乳动物细胞表现出低毒性、良好的药理学特性和更广泛的活性谱。对它们进一步的深入研究有望加速新型抗真菌药物的更新，为临床提供更多的选择。