侵袭性真菌感染分子病理诊断进展

刘晓 李若瑜 宋营改

(北京大学第一医院皮肤科，北京大学真菌和真菌病研究中心，北京市皮肤病分子诊断重点实验室，国家皮肤与免疫疾病临床医学研究中心，北京 100034)

真菌感染是一个全球关注的人类健康问题。侵袭性真菌感染(invasive fungal infection, IFI)在重症患者及免疫抑制人群中具有较高的发病率和病死率[1-3],以念珠菌感染最常见，可达53%[4]，其次为曲霉、毛霉及隐球菌[5]。侵袭性曲霉病及毛霉病临床表现缺乏特异性，病原学诊断困难，往往术后或尸检才能诊断，缺少精确的诊断方法。组织病理学是诊断侵袭性真菌感染的金标准之一。由于不同真菌在组织中的形态类似，仅通过HE染色、各种特殊染色方法观察真菌形态特征来鉴定感染真菌的属和种比较困难，尤其是难以区分曲霉、毛霉、镰刀菌及赛多孢霉等丝状真菌感染[6]。福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织中病原真菌的早期诊断并将致病菌种鉴定至种，对提高诊断水平、精准治疗及改善预后至关重要。分子病理诊断是准确诊断病原真菌的重要检测手段，现对侵袭性真菌感染分子病理诊断方法的研究进展进行综述。

1 FFPE组织中聚合酶链式反应(PCR)及产物分析

PCR技术作为诊断FFPE组织中真菌感染的分子诊断方法之一，具有高效、快速、准确的特点。

2017年ESCMID-ECMM-ERS[欧洲临床微生物与感染性疾病学会(ESCMID)-欧洲医学真菌学联盟(ECMM)-欧洲呼吸学会(ERS)]指定的曲霉病诊断和治疗指南[7]中指出：宽范围(broad-range) PCR用于鉴别可见菌丝的新鲜组织或石蜡包埋组织中真菌的种、属具有较高证据等级(AII级)，而对于未见菌丝的活检组织则属于CII级。但FFPE组织PCR在DNA提取、引物的选择、PCR平台选择方面仍缺乏统一标准。不同研究发现PCR诊断FFPE组织中真菌感染的阳性率15%～90%不等，但特异性较高。PCR阳性率高低的决定因素包括组织样本的选择、DNA的提取、DNA的污染、引物的选择、PCR平台的选择等[8]。

1.1 组织样本的选择

①样本的大小：Gomez等[9]利用ITS2区和D2区引物对FFPE组织和新鲜组织进行PCR，发现手术切除标本的诊断率(71.5%)高于芯针活检(50.0%) 和细针抽吸活检(0%)，结果显示组织样本的大小对于PCR的诊断率存在影响；②样本含菌量的多少：Dadwal等[10,11]指出由于FFPE组织中真菌负荷量低或DNA片段化，可能造成敏感性降低(敏感性为57%，而特异性为100%)。

1.2 DNA的提取

由于FFPE组织中DNA降解以及DNA交联的存在，DNA提取更为困难，使得FFPE组织PCR的阳性率明显低于新鲜组织。目前DNA的提取多采用商业化的试剂盒，不同试剂盒提取DNA的效率有所差异，其中自动提取试剂盒的效率最高。在不使用溶细胞酶情况下，MO BIO BiOstic FFPE Tissue DNA Isolation Kit可以分离出更高质量的真菌DNA[12,13]。

1.3 DNA污染

DNA污染包括提取过程中其他真菌的污染以及宿主组织DNA的干扰。操作应在生物安全柜中进行以避免空气中真菌的污染。对于组织DNA的干扰：更为优化的方案是基于激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection, LCM)提取DNA，将组织切片染色，精准切割病原真菌。LCM是一种有价值的工具，可在小样本组织中获得大数据[14]，帮助研究人员从复杂的异质生物样品中对单个细胞或一组细胞进行选择性取样。其UV-LCM的基本原理[15]是利用波长为337 nm的脉冲UVA激光，从乙烯乙酸乙烯酯膜上分离特定大小的细胞或组织区域，通过聚焦激光束的激光压力弹射，将分离的细胞或组织区域转移到放置在分离区域下方的离心管盖中。LCM不仅在肿瘤、细菌及病毒感染的诊断中发挥重要作用，近年来也发现其在真菌感染中具备诊断潜力：赵作涛等[16]利用LCM成功鉴定了皮肤FFPE组织中的隐球菌感染；Schofield[17]成功捕获鉴定小鼠舌组织中的白念珠菌感染；Zhou等[18]利用LCM-PCR技术成功鉴定1例人类肺FFPE组织单用PCR技术难以确诊的长枝木霉病原菌感染；Olias等[15]利用LCM对鸟类肺组织中曲霉菌的感染进行鉴定，证实基于LCM的分子鉴定具有普遍适用性；Wang等[19]利用LCM-PCR技术，诊断小鼠侵袭性肺曲霉病的灵敏度达到89%，特异度为100%，表明以LCM为基础的PCR技术在准确诊断侵袭性肺曲霉病方面有较大的潜力。由于在整个组织的分析中，含量较少的真菌DNA可能会被组织DNA稀释、混淆，LCM成功克服这一缺点，为获得不受周围组织成分污染或污染程度极低的纯特异性细胞提供可能。

1.4 引物的选择

引物可以是泛真菌引物亦可为种、属特异性引物；引物靶点多针对真菌的ITS1、ITS2区以及18S rRNA、5.8S rRNA、28S rRNA基因。由于真菌混合感染可能性的存在，选择泛真菌PCR尤为重要。对于泛真菌引物而言，针对ITS1、ITS2区的序列使用率较高[20,21]。28S rDNA的D1/D2区、18S rDNA具有较高的属鉴别能力[8,22-23]。由于FFPE组织中真菌DNA受到福尔马林影响，PCR引物扩增DNA片段长度以短于300 bp最为合适。

1.5 PCR平台的选择

目前PCR常用的平台为传统PCR、巢式PCR、实时定量PCR。巢式PCR及实时定量PCR具有更高的灵敏度，但选择何种平台目前尚无确定标准。选择合适的引物及平台可将诊断的灵敏度提高至79.3%～96%[24,25]。

1.6 PCR扩增产物的分析

测序技术从第1代测序发展到第3代测序，而FFPE组织提取DNA行PCR扩增后多进行第1代测序。第1代测序技术具有操作快速、简单的优势，对ITS区测序可鉴定大多数真菌菌种，目前被广泛应用于中、小片段DNA测序鉴定。第2代及第3代测序使得全基因组测序进一步发展，具有通量高和读长较长的优势，可大大降低测序成本，提高测序速度和效率。目前第3代测序技术尚未在FFPE组织DNA中应用。

2 荧光原位杂交技术(fluorescence in Situ hybridization, FISH)

荧光原位杂交技术(FISH)作为一种基于组织学并进行原位观察的分子诊断技术，可避免实验人员暴露于危险病原微生物，具有较好的应用前景。其基本原理[26]是根据两条同源单链核酸在合适的杂交条件下按碱基配对形成双链的原理，利用荧光标记探针检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列。有多种因素可以影响原位杂交对目标DNA或RNA序列的检测，包括组织片段的预处理、杂交缓冲液中甲酰胺的浓度、冲洗液中NaCl的浓度、探针序列以及杂交的有效性。目前在荧光强度及探针选取方面仍存在一定限制。在高pH值的溶液中高温加热可有效增强探针结合强度(pH 9.5, 95℃)[27]。常用的探针包括RNA探针、dsDNA探针、寡核苷酸(DNA)探针、LNA(Locked nucleic acids)探针及PNA探针，LNA、PNA探针与DNA探针相比具有较强的荧光信号[28]。

国内外已有较多关于原位杂交技术用于组织中病原真菌鉴定的文献报道。FISH常用于念珠菌病的诊断，其对诊断酵母菌的灵敏度要高于丝状真菌[29]。PNA-FISH可用于鉴别念珠菌及毛孢子菌[30]。但FISH在丝状真菌的诊断方面研究较少，可以确定的是针对烟曲霉ALP基因的特异性dsDNA探针、镰刀菌属28S rRNA的PNA探针具有较高的诊断价值[31,32]。而毛霉因其D1-D2区的高度异质性，故难以设计针对28S rRNA基因的毛霉目特异性探针[29]。针对28S rRNA基因、18S rRNA基因的泛真菌探针诊断灵敏度可达60%～80%[33-34]。表明针对rRNA靶点的FISH已成为诊断FFPE组织中真菌感染的有效手段。

3 小 结

侵袭性真菌感染的分子病理诊断技术在不断成熟。目前的研究中值得肯定的是，PCR技术：对于组织病理可见真菌成分者，泛真菌PCR技术的价值肯定，已被写入2017 ESCMID-ECMM-ERS侵袭性曲霉病诊疗指南中 (AII)；FISH技术：用于酵母菌的诊断比较稳定，对于丝状真菌，针对烟曲霉ALP基因的dsDNA探针和镰刀菌属的PNA探针具有一定的诊断价值。分子病理在侵袭性真菌感染的早期诊断方面发挥着至关重要的作用，但由于PCR技术在各个层面尚缺乏标准化、存在假阳性的可能，以及FISH对于丝状真菌特异性探针的缺乏，两者目前尚未在临床推广应用。因此需要进一步优化、筛选PCR引物和针对丝状真菌的FISH特异性探针，建立一套标准化、具有稳定的高灵敏度及特异度的分子病理诊断方法，高效、快速、准确地将致病真菌鉴定到种水平，以便于临床选择敏感抗菌药物，有效治疗疾病，改善患者预后，降低死亡率。