砷尾矿污染土壤的细菌群落结构多样性及其相关环境影响因子分析

张堃，徐颖，周媛，黄华枝，廖俊杰，李林，朱永闯，廖斌，梁洁良，李金天

1. 广东轻工职业技术学院生态环境技术学院，广东 广州 510300；2. 中山大学生命科学学院，广东 广州 510275；3. 华南师范大学生命科学学院生态科学研究所，广东 广州 510631

砷（As）广泛存在于自然界的地壳、沉积物和土壤圈等各种环境介质中，是一种氧化还原敏感元素，在特定条件下易被激活。五价砷和三价砷最为常见，而三价砷的高移动性使得其环境毒性远高于五价砷，即使在低浓度下也会对生物群产生毒性作用（Palmer et al.，2019）。为了抵消砷的有害影响，微生物进化出了不同的抵抗策略，能将亚砷酸盐氧化或甲基化成毒性较小的类型，或主动使亚砷酸盐泵出细胞。其中具有砷氧化功能的微生物如根瘤菌可以将毒性较强的三价砷氧化为毒性较低的五价砷并使其与铁铝矿物结合（Corsini et al.，018）；而砷还原微生物如金黄色葡萄球菌等则可以将毒性较弱的游离砷和结合态砷还原为毒性更强的三价砷从而加重环境砷污染（Ji et al.，1994）。这些微生物的代谢活动是砷元素迁移、转化、甲基化和脱甲基化等过程的关键因素，不断促进土壤中砷及其化合物的相互转化，同时过程中易伴随产生强酸且含有较高水平的溶解态金属离子（如砷、镉、铜、锌等）以及阴离子（如硫酸盐和碳酸盐等），对周边生态环境造成较大的胁迫。

湖南石门拥有世界最大的雄黄矿，某些尾矿矿渣的砷含量接近并超过低品位原矿石中的砷含量（胡毅鸿等，2015）。以雄黄矿为主的矿体中，通常含有较高含量的金属硫化物，当硫化物暴露于空气和水分下，容易被一些噬酸铁氧化菌（Acidobacillus Ferrooxidans）和硫氧化菌（Thiobacillus acidophilus）氧化，从而加速结合态或螯合态重金属的释放和硫酸的产生，使尾矿迅速酸化及重金属化（Shiers et al.，2016）。然而微生物群落整体代谢过程复杂，具有特定功能的菌群与不同有害重金属之间的关联等研究尚不透彻。本研究以湖南石门雄黄尾矿污染土壤为研究对象，对尾矿区域的土壤理化特性进行测定，通过16S rRNA基因高深度测序，揭示不同土壤深度及不同水平距离下的砷污染土壤中微生物群落结构多样性组成及分布格局，探讨核心类群对环境因子变化趋势的群体组装模式，为砷尾矿的环境控制和生态修复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

雄黄矿位于湖南省常德市石门县白云乡（29°39′6.83″N，111°2′27.07″E），属于中亚热带向北亚热带过渡的季风气候区；境内年平均气温16.8 ℃、年均降雨量1540 mm；土壤类型为黄棕壤酸性土。矿区有一、二、三号窿，研究区位于一号窿尾矿库，其具有典型的3层结构模式（顶部为硅质岩层，中部为网脉状矿体，下部为角砾状矿体），已开采至-370 m标高，垂深达550 m，斜深超700 m。

1.2 土壤样品采集

一座人工堆砌的矿渣岩壁斜侧，按北向横向距离远近分为原位、100、200、300 m共4个随机采样点，土壤鲜有植物生长覆盖，采集0—10 cm的表层土，分别命名为HX0，HX1，HX2，HX3；其中HX0同时设置为纵向剖面研究点，往下分别按0—10、30—40、50—60、60—70 cm分为4个子采样点，统一命名为 ZP0（即 HX0），ZP1，ZP2，ZP3。每个采样点半径1 m范围随机选择4个位置采集等量土壤，然后混合均匀成为一份样品；4次重复，共计 28个土壤样品。样品一部分装入灭菌的离心管中，-80 ℃冰箱中储存，用于后续DNA提取；另一部分放入封口袋中用于理化参数测定。

1.3 土壤样品理化分析

土壤中的pH、EC、TOC用无二氧化碳水对土壤进行浸提后，分别采用pH计、电位法、电导法、总碳分析仪（TOC-Vcsh；Shimadzu，Kyoto，Japan）测定；土壤风干研磨过 80目筛后，用盐酸和硝酸溶液处理，在微波消解炉中消解冷却后定容，使用电感耦合等离子发射光谱仪ICP-OES进行砷、铅、锌、铜等重金属元素测定，其中对于砷形态的测定主要采用不同化学浸提剂，将样品中各种形态的无机砷酸盐加以逐级分离、计算。具体操作方式参考蒋永荣等人的研究（蒋永荣等，2019）。

1.4 土壤样品DNA提取及16S rRNA基因测序

采用FastDNA土壤DNA提取试剂盒（MP Bio，USA）根据提取说明书进行总 DNA提取，用NanoDrop2000微量紫外分光光度计（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）测定 DNA的浓度和质量。选择细菌古菌通用引物对 515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）/806R（5′-GGACT ACHVGGGTWTCTAAT-3′）扩增 16S V4 区（Caporaso et al.，2011），扩增体系及条件参考Zhang et al.（2019）的研究；PCR产物进行电泳检测并采用OMEGA胶回收试剂盒（Omega Bio-Tek）对目标条带进行纯化回收；回收产物由北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行深度测序。

1.5 16S扩增子高通量数据分析

获得的原始数据采用 FLASH（版本号 1.2.11）软件进行双端序列合并，采用QIIME软件进行流程化分析（Caporaso et al.，2010），具体包括根据标签序列进行样品拆分、数据质量控制及嵌合体去除、序列聚类，比对SILVA（版本号123）进行物种注释。样品内部微生物物种组成多样性主要以Chao1、PD、Shannon和Simpson 4个多样性指数来表征；样品间β多样性指标以Bray-Curtis PCoA（Principal Coordinate Analysis）表征。

1.6 土壤重金属潜在生态危害影响因子计算及评价方法

潜在生态指数法（The Potential Ecological Risk Index，RI）由瑞典地球化学学家Hakanson于1980年提出，是目前最常用的评价重金属环境污染度的方法之一（Hakanson，1980）。其具体公式如下：

1.7 数据统计方法

采用 Vegan（版本号 2.4.2）进行非冗余分析（Redundancy analysis，RDA）和方差分解分析（Variance partitioning canonical correspondence analysis，VPA）；采用R包中的Pheatmap（版本号1.0.12）绘制热图；采用Gephi（版本号0.9.2）进行相关性网络图绘制及美化，阈值选择为相关性系数|r|≥0.6，P＜0.05；采用 R（版本号 4.0.3）进行相关性统计分析，P＜0.05定义为差异显著。将所有28个样品中都存在的 OTU定义为共享类群（Shared microbiota）或核心类群（Core microbiome），获得的结果在门、纲、目、科、属级别进行丰度计算；同时将所有样品中平均相对丰度＞1%的类群定义为主要类群，其余的为稀有共有类群（Gülay et al.，2016）。

2 结果与讨论

2.1 土壤样品有害重金属含量及潜在生态危害评估

对共计28个土样进行了有害重金属（砷、铅、锌、铜、镉）总含量的测定（表1）。结果表明：土壤纵向越深，重金属含量越大；横向距离越远重金属含量越低。所有样品中砷（1804.75 mg·kg-1）、铅（626.54 mg·kg-1）、锌（290.68 mg·kg-1）、铜（168.82 mg·kg-1）、镉（31.46 mg·kg-1）的几何均值均高于湖南省土壤重金属含量背景值，分别超标 45.12、21.1、18.51、6.18、249.68倍。在郭朝晖等人的湘江农田污染土壤研究中则发现镉、铅、锌的样品几何均值分别超标湖南省土壤背景值的 7.97、3.69、1.63倍，判定湘江沿岸的农田土壤镉污染比较严重（郭朝晖等，2010）；同样本次结果表明矿区及周边土壤较高浓度的重金属水平可能会对周边区域的农田种植或地下水造成严重的影响。

表1 不同土壤样品重金属浓度及生态危害指数Table 1 Contents and ecological hazard indexes of heavy metals in different soil samples

依据 Hakanson的潜在生态危害指数法计算公式得出，土壤中各个重金属的潜在生态危害指数Ei与重金属的含量变化规律基本一致。综合比较土壤中各有害重金属的生态危害指数值，发现锌（Ei=18.51）与铜（Ei=30.92）的潜在生态危害较小，均为轻度危害（Ei＜40，轻度危害）；铅（Ei=105.48）具有强生态危害（80≤Ei＜160）；而砷（Ei=565.75）和镉（Ei=7491.5）的污染最严重，达到极强的环境危害标准（Ei≥320）。所有样品都具有极高的潜在生态风险（RI≥600），并且纵向样品中RI与采样深度呈显著正相关（r=0.79，P=0.000），横向样品中RI与采样距离显著负相关（r= -0.85，P=0.000）。说明重金属随着时间的推移会逐渐往土壤深层迁移累积，横向扩散的效应相对较弱。相似的结果也出现在蒋永荣等研究的广西桂林阳朔一处铅锌尾矿污染土壤中（蒋永荣等，2019）。

2.2 微生物群落α及β多样性变化规律

28个样品的序列条数均一化至25045条进行α多样性抽样计算，表2显示矿渣堆近处的土壤微生物多样性显著降低，离矿渣堆越远，多样性呈缓慢上升趋势；而土壤纵剖面随着深度增加，物种多样性显著减少。结合土壤理化背景值分析发现，重金属含量越高的土壤，微生物多样性相对越低。此结论与已有研究相符（Chen et al.，2014；Xie et al.，2016），同时本研究也通过方差分解分析（VPA）得出重金属是影响尾矿土壤微生物结构组成解释度最高的单类环境变量（图1），很大程度决定着该区域微生物群落的组成结构：提示重金属含量越高对微生物类群造成的非生物胁迫越大，而这种选择压力会促进微生物群落迅速进化，淘汰无法适应的类群，逐渐保留具有较强适应性的菌群。

图1 三大类理化参数对微生物群落结构影响的方差分解分析Fig. 1 Variance Partitioning Analysis (VPA) of the three categories of physicochemical indices on microbial community composition

表2 α多样性指数组间差异显著性统计结果Table 2 The significant difference of the alpha indices among each group

基于 OTU table表格进行 Bray-Curtis PCoA（Principal Coordinate Analysis）计算并产出散点图（图2），以展示样品间基于物种类型和丰度的整体分布趋势。图中轴一和轴二叠加解释了土壤菌群多样性变异度总值约33.66%，结果显示纵剖的样品与横向取样的样品各自聚类分明。同时，纵剖的样品随着轴2分布明显，ZP0的样品与ZP1的样品随着轴一大致区分；而横向采样的样品HX1和HX2样点聚类在一起，说明两个点的样品物种更为相似，与HX3的样品物种组成差异较大。

图2 Bray-Curtis PCoA（Principal Coordinate Analysis）散点聚类图Fig. 2 Bray-Curtis PCoA (Principal Coordinate Analysis) based on OTU table information

2.3 微生物群落门、科、属组成规律

本研究共获得10806个非冗余OTU类型，获得有效物种注释的25门、63纲、83目、169科、437种。细菌优势门的组成相对丰度如图3A所示，变形杆菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）的平均相对丰度约为 54.35%和22.39%，占主导地位；其余的拟杆菌门（Bacteroidetes）、衣原体门（Chlamydiae）、厚壁杆菌门（Firmicutes）及疣微菌门（Verrucomicrobia）的平均相对丰度分别约为3.18%、3%、2.68%和2.1%，丰度相对较低。Ghosh et al.（2018）在锰矿尾矿污染土壤中同样发现了变形杆菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）两个主要门类；同样Yan et al.（2020）在金矿尾矿污染区域发现大部分的重金属抗性类群也归属于这两个门。

图3 物种组成柱状图A与B图分别为TOP10的门及属层级的物种组成柱状图Fig. 3 Microbial composition. A and B represented the bar chart of the TOP10 taxa on Phylum and Genus level, separately

在属层级下，图3B显示假单孢杆菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）和硫杆菌属（Acidithiobacillus）平均相对丰度分别约为17.37%、8.62%和 7.85%，丰度相对较高；其次雷尔氏菌属（Ralstonia）、分支杆菌属（Mycobacterium）和鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium），平均相对丰度分别约为2.91%、2.84%和1.62%），是平均丰度大于 1%的主要属类别。上述的几个丰度较高的类群大都被报道具有耐高砷或进行砷代谢的能力，被用来进行砷污染的修复（Karn et al.，2016；Páez-Espino et al.，2020）。

2.4 所有样品共有的核心微生物组分析

由于尾矿样品存在多种重金属污染，理化性质差异较大，对核心类群的研究更利于发现具有较高适应能力的细菌群体组成。图4A左边柱状图结果显示，所有样品中的核心类群在门、纲、目、科、属分类层级上，各自占比约59.26%、53.66%、57.25%、46.27%、25.92%，当把类群丰度考虑在内时，属层级上，所有分组中核心类群平均占比超过90%（图4A右边丰度柱状图）。

图4 所有样品中共享的核心类群的丰富度、丰度和物种信息Fig. 4 Richness, abundance and identity of taxa shared across all samples

同时，我们构建了核心类群在属层级的物种分布热图，排除了那些没有特定物种谱系的共享属，仅考虑具有明确物种定位的已知属在所有样品中的分布规律。图4B显示一共保留26个属，横向样品和纵剖样品基本能各自很好的聚类，说明核心物种丰度分布在两种取样方式间差异明显。具体结果显示铁线菌属（Ferrithrix）、硝化螺旋菌属（Nitrospira）、乳杆菌属（Lactobacillus）、硫化杆菌

属（Sulfobacillus）、硫酸状杆菌属（Acidithiobacillus）、铁原体属（Ferroplasma）、不动杆菌属（Acinetobacter）和雷尔氏菌属（Ralstonia）在纵剖样品中丰度分布相对高于横向采集的样品。除去已明确功能的不动杆菌属的一些种，有研究表明铁线菌属是一种铁/硫氧化性异养极端嗜酸性放线菌（Rathna et al.，2020）；硝化螺旋菌属被认为是可以进行亚硝酸盐氧化功能的最多样化和最广泛分布的一个属（Daims et al.，2016）；乳杆菌属中Lactobacillus plantarum被证明是具有缓解或进行重金属修复的功能菌（Ameen et al.，2020）；而硫化杆菌属和硫酸状杆菌属被广泛报道具有重金属抗性的能生物吸附重金属离子的工程菌（Dopson et al.，2014，Huang et al.，2020）；研究显示铁原体属对砷极具抵抗力的一种古菌（Baker-Austin et al.，2007）。此外，链球菌属（Streptococcus）、鞘脂杆菌属（Sphingobacterium）、地杆菌属（Geobacter）、硫杆菌属（Thiobacillus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、假单孢杆菌属（Pseudomonas）、嗜酸菌属（Acidiphilium）等均在横向样品中丰度较高，同样这些菌都被报道过具有重金属抗性或分离自极端生境中，能在重金属含量较高的极端生境中存活（Methé et al.，2005；Ordóñez et al.，2005；Holmes et al.，2009；Rafiq et al.，2019）。

综上，雄黄尾矿污染的土壤中少数类型的核心属在整体微生物群落中占据绝对优势，这些特定的属均被报道具有耐高砷或代谢重金属的功能。纵剖采样与横向采样的土壤，其核心类群的丰度及分布趋势并不相同。

2.5 微生物群落与理化相关性分析

本研究采用了冗余分析（RDA）来研究影响土壤微生物群落结构的主要环境变量成分，将门层级的物种组成及所测得的环境理化因子进行共线性分析，见图5A（轴1方差解释度=57.97%，轴二方差解释度=17.4%）。图中箭头长度表示环境因素与样本分布的相关程度，5种有害重金属中铅、镉、砷对样品中物种组成解释度较高，而锌与铜则影响较弱；砷的各种形态中，铝型砷对于所有样品的物种组成解释度最高，各种形态间彼此具有正相关性；二价铁的影响是所有环境参数中影响最小的因子，总铁的影响相对较高。物种垂直于理化线或其延长线的垂直距离原点的远近体现二者相关强弱，结果显示拟杆菌门（Bacteroidetes）、衣原体门（Chlamydiae）与硫酸根、TOC、二价铁、总铁、pH、铅和锌呈较强正相关，而与其余环境参数成较强负相关；放线菌门（Actinobacteria）、硝化螺旋菌门（Nitrospira）、疣微菌门（Verrucomicrobia）与总硫、单质硫、总砷、游离砷、各类结合态砷、镉呈正相关，而厚壁杆菌门（Firmicutes）、酸杆菌门（Acidobacteria）及广古菌门（Euryarchaeota）受到的环境参数的影响相对较弱。

图5 理化与微生物相关性分析Fig. 5 Correlation analyses of physicochemical indices and microbial taxa.

为研究各类环境参数值对微生物主要类群的影响，我们绘制了TOP 100的OTUs及环境参数共存网络图（Co-occurrence network）（图5B），结果显示一共产生257条相关性线条，包含115条正相关关系和142条负相关关系，大部分的OTUs与多个环境影响因子具有相关性。其中Cd和As是最主要的环境影响因子，分别影响了32个和31个不同类型的 OTUs（相关系数|r|≥0.6，P＜0.05），其次 Pb、Zn和总铁影响了超过20个不同类型的OTUs，而TOC、游离态砷、黄铁矿硫以及二价铁对 OTUs的影响较低，各自影响的OTUs类型数目在10个以下。

为明确核心物种与理化相关性，本研究把鉴定获得的所有样品中的核心微生物类群（属层级）与环境因子进行相关性共存网络图分析（相关系数|r|≥0.6，P＜0.05）（图5C），用来揭示关键类群在不同环境因子下的相关性大小。结果显示较高丰度的假单孢杆菌属（Pseudomonas）、硫杆菌属（Thiobacillus）、链球菌属（Streptococcus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、水杆菌属（Aquabacterium）以及分支杆菌属（Mycobacterium）构成一个最大的相互正反馈的集合，并且与铁型砷、铝型砷、闭蓄型砷含量成显著性负相关，但与总砷成显著正相关。已有研究表明前四种菌均已明确具有亚砷酸氧化功能，而Corynebacterium则被报道具有依赖硝酸盐亚铁氧化功能（Zhang et al.，2016），产生三价铁推测可在体外与亚砷酸产生非生物氧化作用。提示这个集合的菌群可能存在将毒性较强的三价砷氧化为五价砷，并使其与铁铝结合而减少砷污染的情况。

其次铁原体属（Ferroplasma）与硫化杆菌属（Sulfobacillus）、硫酸状杆菌属（Acidithiobacillus）构成了正相关的集合（Module），在此集合中，与游离态砷和亚铁成显著正相关，与pH成负相关，且整体与假单孢杆菌属（Pseudomonas）菌群集合以负相关为主，有研究表明Sulfobacillus的某些种在氧气限制条件下倾向于利用三价铁作为电子受体进行耦合还原反应（Tsaplina et al.，2010），而Acidithiobacillus则被报道存在厌氧硫代谢与异化铁还原的耦合行为（Mangold et al.，2013），虽然该属的某些种也被报道具有砷氧化功能。本次结果提示该集合可能存在通过还原三价铁，消耗氢离子，结合不同的机制促进砷的释放加重环境污染。

此外，具有显著抗砷功能的不动杆菌属（Acinetobacter）与雷尔氏菌属（Ralstonia）和总碳形成一个显著正相关的集合，提示环境营养程度对这两个属的物种的生长具有非常重要的促进作用。大部分具有重金属耐性的核心类群之间可能存在功能互补促进彼此对极端生境的耐受性。

3 结论

本研究以湖南省石门县雄黄矿废弃地的砷污染土壤为研究对象，进行了不同土壤层深度和不同水平距离的土壤中有害重金属浓度及其危害程度的研究，以及不同样品微生物群落的变化趋势及理化物种相关性分析。研究发现该区域重金属含量严重超标；重金属在土壤中随着时间累积会存在纵向迁移现象，随着横向距离的加大重金属含量浓度递减。VPA及RDA分析结果表明，有害重金属是影响土壤微生物群落组成多样性最关键的因素，尤以砷和镉最为重要。

横向样品和纵向样品物种组成差异较大，特别是依据优势共享属与理化共存网络图的结果分析，横向样品中的嗜酸菌属（Acidiphilium）、假单孢杆菌属（Pseudomonas）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、硫杆菌属（Thiobacillus）以及水杆菌属（Aquabacterium），可能具有促进砷的固定，降低砷的环境污染功能；而纵向样品中的铁原体属（Ferroplasma）、硫酸状杆菌属（Acidithiobacillus）、硫化杆菌属（Sulfobacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、硝化螺旋菌属（Nitrospira）等，则有加速环境中固定砷的释放，加重砷污染的可能。后续研究可以结合宏基因组Binning技术，深入研究有益菌群耐砷及代谢互作机制，为制作复合菌剂以及处理深层土壤砷污染做理论铺垫。