杜仲叶提取物所含四种主要成分体外抗非酒精性脂肪肝活性研究＊

蔡丹红，薛 梅，李 玉，朱思睿，刘笑利，张 良

（南京中医药大学药学院/江苏省中药药效与安全性评价重点实验室 南京 210023）

1 介绍

非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明确损肝因素外所致的肝细胞内以脂肪过度累积（脂肪变性）为主要特征的临床病理综合征[1]。随着生活水平的提高，该病在全球呈流行趋势。截止2018年，全球NAFLD 患病率为25.24%，而我国NAFLD 的患病率为20.09%，其已成为威胁人类健康的一大因素[2]。NAFLD 的发病机制复杂，目前NAFLD经典的“二次打击学说”被人们广泛接受，“第一次打击”是大量脂质在肝脏细胞内过度积累。这个累积过程与胰岛素抵抗（Insulinresistance，IR）有关，胰岛素浓度升高，导致外周脂肪组织发生分解，使得肝脏从血液中摄取的游离脂肪酸增多。同时游离脂肪酸氧化会随着胰岛素浓度升高而减弱，造成肝脏内大量游离脂肪酸转化为三酰甘油，形成单纯性非酒精性脂肪肝。“二次打击”是指“一次打击”之后，蓄积在肝脏的大量脂质发生氧化应激（Oxidation stress，OS）与脂质过氧化（Lipid peroxidation，LPO）引起肝细胞炎症、肝纤维化、肝硬化、甚至肝细胞癌[3]。目前临床上治疗NAFLD，主要有降脂药如非诺贝特类、洛伐他汀类；降糖药如双胍类、胰高血糖素样肽（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）受体激动剂和二肽酰肽酶4（Dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）抑制剂；抗氧化剂如维生素E（Vitamin E，VE）、还原性谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、水飞蓟素等；肝保护药物如熊去氧胆酸（Ursodeoxycholic acid，UDCA）；FXR 激动剂如奥贝胆酸等。目前，尚无明确药物治疗NAFLD。因此，寻求防治NAFLD 药物并探讨其作用机制迫在眉睫。

杜仲为杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoidesOliv）的干燥树皮，是我国传统药材，在我国有两千多年的药用历史。《神农百草经》将其列为上品，性温，味甘，归肝、肾经，具有补肝肾，强筋骨，安胎的功效，用于治疗肝肾不足，腰膝酸痛，筋骨无力，头晕目眩，妊娠漏血，胎动不安等，被广泛用于中药临床复方和多种中成药中如杜仲降压片和强力天麻杜仲胶囊。由于杜仲传统药用部位为皮部，树龄达到一定年限方可剥皮，且剥皮后极易造成杜仲树死亡，对杜仲资源造成极大浪费，严重影响杜仲资源的可持续发展。为解决这种问题，人们相继开展了对杜仲其它非传统药用部位化学成分和药效研究，其中杜仲叶、雄花、种子等部位的研究较为显著[4]。在2005年《中国药典》将杜仲叶单独收载为一种药材，随后的2版药典一直沿用[5]。杜仲叶成分丰富，主要含有黄酮类、木脂素类、环烯醚萜类、多酚类、萜类和甾体类、苯丙素类、多糖类等成分[6]，具有抗氧化、降血压、调节血脂、降血糖、抗骨质疏松、抗疲劳、预防肥胖、抑菌等药理作用[7]。临床上主要用于治疗高血压、高血脂、高血糖、安胎及骨质疏松等[8,9]。有相关报道显示[10,11]，杜仲叶提取物能显著降低高脂饮食诱导肥胖小鼠血浆中高血糖和高血脂水平，改善肝脏脂肪变性，对防治NAFLD 有明显作用。然而，目前杜仲叶提取物防治NAFLD的活性成分及其作用机制尚不清楚。因此研究杜仲叶提取物防治NAFLD的主要活性成分及其作用机制意义重大。

2 材料和方法

2.1 材料仪器

HepG2 细胞系获自中国科学院细胞库（中国上海）储存于-80℃冰箱，南美胎牛血清（Gibco），青链霉素双抗（Solarbio），DMEM培养基（Gibco，Lot：8119288），胰蛋白酶（Gibco），TG试剂盒（批号：20190716）、TC试剂盒（批号：20190511）、HDL-C试剂盒（批号：20190713）、LDL-C 试剂盒（批号：20190712）、ALT 试剂盒（批号：2090715），AST试剂盒（批号：20190716）购于南京建成科技有限公司，棕榈酸标准品（批号：SLBQ8869V），绿原酸标准品（批号：Y24J7K16726）、杜仲苷标准品（批号：K02N7B23963）、车叶草苷标准品（批号：ZN1110BB14）、京尼平苷酸标准品（批号：Y02A9H57757）购于上海源叶科技有限公司，UPLC（美国waters 公司），Discovery V20倒置荧光显微镜（德国Zeiss公司），Synergy HT型酶标仪（Bio-Tek，USA）。

2.2 杜仲叶提取、分离、纯化、冻干

将杜仲叶粉碎，采用60%乙醇在80℃蒸馏提取，第1 次提取3 h，第2 次提取2 h，提取后，合并提取液，纱布过滤，滤液经NKA-2 树脂柱洗脱纯化，纯化后滤液在60℃下减压蒸馏浓缩，回收乙醇，得到杜仲叶提取物浓缩液，杜仲叶提取物浓缩液进行冷冻干燥制成杜仲叶提取物冻干粉，杜仲叶提取物冻干粉置干燥器中保存。

2.3 细胞培养

将HepG2 细胞在补充有10%胎牛血清，1%青霉素/链霉素的DMEM 培养基中，于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。当细胞汇合度达到80%时，采用0.25%胰蛋白酶消化，按1:3进行传代。

2.4 实验分组及给药

取对数生长期的细胞，调整细胞细胞密度为2 ×105Cells·mL-1，接种于6 孔板。设正常组、模型组、绿原酸组、杜仲苷组、京尼平苷酸组、车叶草苷组。绿原酸组给药40µmol·L-1、杜仲苷给药40µmol·L-1、京尼平苷酸组给药40µmol·L-1、车叶草苷组给药40µmol·L-1。

2.5 NAFLD细胞模型的建立

根据前期试验选择最佳棕榈酸干预浓度为300µmol·L-1模拟高脂环境，建立NAFLD 细胞模型，干预HepG2细胞24 h。

2.6 油红O染色

将HepG2细胞制备细胞悬液，调整细胞密度为1×105Cells·mL-1，接种于24 孔板。设正常组、模型组、绿原酸组、杜仲苷组、京尼平苷酸组、车叶草苷组，37℃、5% CO2培养箱培养12 h，待细胞完全贴壁后，用棕榈酸处理HepG2细胞24 h，建立NAFLD细胞模型。绿原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、车叶草苷给药48 h 后，弃培养基，PBS 冲洗2 次，4%多聚甲醛1 mL 固定细胞30 min，弃4%多聚甲醛，PBS 清洗2 遍，加入500µL 油红O 工作液（三蒸水∶油红O = 2∶3）37℃避光30 min，50%异丙醇洗涤15 s，双蒸水清洗3 次，至背景透明，倒置显微镜拍照，采用Image软件分析图像。

2.7 细胞中TG、TC、LDL-C、HDL-C的检测

取对数生长期的细胞，调整细胞密度为2×105Cells·mL-1，接种于6 孔板，于37℃、5%CO2培养箱中过夜，待细胞生长至70%-80%。设正常组、模型组、绿原酸组、杜仲苷组、京尼平苷酸组、车叶草苷组每组设置5个复孔，用棕榈酸处理HepG2细胞24 h，建立NAFLD细胞模型。绿原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、车叶草苷给药48 h 后收集细胞，细胞超声破碎仪超声裂解，按照TG、TC、HDL-C、LDL-C试剂盒说明书进行检测。

2.8 细胞上清液中AST、ALT检测

取对数生长期的细胞，调整细胞密度为2×105Cells·mL-1，接种于6孔板，于37℃、5%CO2培养箱中过夜，待细胞生长至70%-80%。设正常组、模型组、绿原酸组、杜仲苷组、京尼平苷酸组、车叶草苷组每组设置5个复孔，用棕榈酸处理HepG2细胞24 h，建立NAFLD细胞模型。绿原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、车叶草苷给药48 h 后，收集细胞培养液，按照AST、ALT 试剂盒说明书进行检测。

2.9 统计学方法

采用GraphPad Prism 5 软件进行相关统计分析，两组之间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），所有数据以±s表示。P＜0.05 视为有显著性差异。

3 结果

3.1 杜仲叶提取物主成分分析

精密称取杜仲苷标准品7.1 mg，京尼平苷酸标准品8 mg，绿原酸标准品5.1 mg，车叶草苷标准品6.35 mg，溶于甲醇中，甲醇定容至5 mL，备用。精密称取69.23 mg 杜仲叶提取物冻干粉溶于80%甲醇，定容至10 mL 备用，精密吸取杜仲叶提取物溶液200µL 并加入甲醇 800 µL，涡旋混匀3 分钟，13000 rpm 离心15 min 备用。用UPLC-MS 检测，流动相：A-乙腈，B-0.1%甲酸；色谱柱：Waters MassLynx 100×2.1 mm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40℃；检测波长：198 nm（绿原酸、杜仲苷、京尼平苷酸），237 nm（车叶草苷）；进样量：10 µL，混合对照品UPLC 图谱和杜仲叶提取物UPLC 图谱（图1），杜仲叶提取物中杜仲苷含量16.72µg·mg-1、京尼平苷酸含量18.37 µg·mg-1、绿原酸含量6.3µg·mg-1、车叶草苷含量0.14µg·mg-1（表1）。

图1 高效液相色谱图

表1 杜仲叶提取物四种化学成分含量表

3.2 杜仲叶提取物四种主成分对HepG2 细胞内脂质的影响

绿原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、车叶草苷（40µmol·L-1）处理HepG2 细胞48 h，油红O 染色检测绿原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、车叶草苷对HepG2 细胞内中性脂肪含量的影响，于光学显微镜下观察（图2）。显微镜下观察可见，肝细胞沉积的中性脂肪呈红色，模型组可见细胞内中性脂肪沉积较多，分布较大。绿原酸组、杜仲苷组、京尼平苷酸组、车叶草苷组与模型组比较，肝细胞内中性脂肪沉积不同程度减少、分布范围缩小，其中京尼平苷酸效果较明显。油红O 染色结果说明，杜仲叶提取物中绿原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、车叶草苷可明显减少HepG2 细胞中中性脂肪的形成，其中京尼平苷酸的效果较好。

3.3 杜仲叶提取物四种主成分对HepG2 细胞内TG、TC、LDL-C、HDL-C含量的影响

图2 HepG2细胞油红O染色（200×）

图3 杜仲叶提取物4种主成分对HepG2细胞内TG、TC、HDL-C、LDL-C的影响

使用TG、TC、LDL-C、HDL-C 试剂盒检测绿原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、车叶草苷给药48 h，HepG2 细胞内TG、TC、LDL-C、HDL-C 的含量（图3）。模型组TG含量显著高于正常对照组（P＜0.001）；模型组TC含量显著高于正常对照组（P＜0.001）；模型组LDL-C 含量显著高于空白组（P＜0.001）；模型组HDL-C 含量与正常对照组比较无显著性变化。与模型组比较，绿原酸显著减少TG含量（P＜0.01）、杜仲苷显著减少TG含量（P＜0.01）、京尼平苷酸显著减少TG含量（P＜0.001）、车叶草苷对细胞中TG 无显著影响，其中京尼平苷酸效果最明显；与模型组比较，绿原酸显著减少TC 含量（P＜0.01）、杜仲苷显著减少TC 含量（P＜0.05）、京尼平苷酸显著减少TC含量（P＜0.001）、车叶草苷显著减少TC含量（P＜0.05），其中京尼平苷酸效果最明显；与模型组比较，绿原酸显著减少LDL-C 含量（P＜0.01）、杜仲苷显著减少LDL-C 含量（P＜0.01）、京尼平苷酸显著减少LDL-C 含量（P＜0.001）、车叶草苷显著减少LDL-C 含量（P＜0.01），其中京尼平苷酸效果最明显；与模型组比较，绿原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、车叶草苷对细胞中HDL-C含量无显著改变。总之，京尼平苷酸降低细胞内TG、TC、LDL-C 效果最好。在NAFLD发生和发展中，蓄积在肝脏中的脂质可发生氧化应激和脂质过氧化，引起肝细胞炎症，肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌，加重了NAFLD 的发展。TG、TC、LDL-C进入血液中可进一步形成高脂血症，可引发其它代谢综合征。实验结果说明，杜仲叶提取物中绿原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、车叶草苷可明显减少HepG2 细胞内TG、TC、LDL-C 的含量，能提高肝脏细胞抗NAFLD活性，其中京尼平苷酸的效果较好。

图4 杜仲叶提取物四种化合物对HepG2细胞培养基中AST、ALT的影响

3.4 杜仲叶提取物四种主要成分对HepG2 细胞培养液中AST、ALT的影响

使用AST、ALT 试剂盒检测绿原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、车叶草苷给药48 h，HepG2 细胞培养液中AST、ALT 的含量（图4）。实验结果显示，模型组与正常组比较，细胞培养液中ALT 显著升高（P＜0.01）、ALT 显著上升（P＜0.001）。与模型组比较，绿原酸可显著减少ALT 含量（P＜0.001）、杜仲苷可减少ALT 含量（P＜0.01）、京尼平苷酸可显著减少ALT 含量（P＜0.001）、车叶草苷可显著减少ALT 含量（P＜0.01），其中绿原酸和京尼平苷酸效果较好。绿原酸、杜仲苷、京尼平苷酸可降低细胞培养液中AST 含量，其中京尼平苷酸效果最好，车叶草苷对细胞培养液中AST 无影响。与模型组比较，绿原酸可显著减少AST 含量（P＜0.001）、杜仲苷可显著减少AST 含量（P＜0.001）、京尼平苷酸可显著减少AST 含量（P＜0.001），车叶草苷对AST 含量无显著影响，其中京尼平苷酸效果最好。总之，京尼平苷酸降低细胞培养液中ALT、AST 效果最好。对于NAFLD 患者AST、ALT 能较好地判断脂肪变性程度以及炎症程度，可用于评估NAFLD 患者预后。实验结果说明，杜仲叶提取物中绿原酸、杜仲苷、京尼平苷酸、车叶草苷可明显减少HepG2 细胞培养液中ALT、AST 含量，能改善NAFLD 模型肝脏脂肪变性和炎症，其中京尼平苷酸效果最好。

4 讨论

1980年Ludwig 等[12]将无饮酒史肥胖和糖尿病（DM）患者出现的非酒精性脂肪肝和肝小叶炎症病变命名为非酒精性脂肪肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH），才步入NAFLD 研究时代。随着生活方式转变，其患病率逐渐上升，西方国家的患病率约为15%-30%，我国约15%，且发病率呈逐年上升和低龄化趋势[13]。NAFLD 主要特征是三酰甘油在肝脏大量蓄积，在不存在肝细胞损伤情况下，被称为单纯性脂肪肝，一般认为是良性的。在存在肝小叶炎症和肝细胞损伤情况下，被称为非酒精性脂肪肝炎。NAFLD 患者易患肝脏相关并发症，如肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）和肝外疾病如心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）和糖尿病[14]。目前，尚没有治疗NAFLD 有效药物，因此开发治疗NAFLD的药物并探讨其作用机制非常有意义。

杜仲是我国特有的药材，其药用历史悠久，在临床上有着广泛的应用。杜仲叶活性成分丰富、药理作用突出、再生循环能力强、产量巨大，是很好的杜仲树皮替代来源。关于杜仲叶对杜仲树皮的替代性研究是目前的一个热点。许多研究结果表明，杜仲叶和杜仲树皮相比，活性成分基本相同，药理作用相似。近年来有研究表明[15]，杜仲叶总黄酮能显著降低高血脂大鼠血清中TC、TG、脂蛋白、载脂蛋白B（Apolipoprotein B，Apo-B）及LDL-C 含量，显著升高HDL-C 及载脂蛋白A（Apolipoprotein A，Apo-A）的含量。有研究表明[16]，杜仲叶多糖能明显降低高血脂模型小鼠血清TC、TG、LDL-C、脂蛋白a 和Apo-B 水平，明显提高HDL-C 和Apo-A 水平。并且有体外研究表明[17]，杜仲叶提取物能通过增强溶酶体活性来降低棕榈酸诱导HepG2 细胞内内质网应激和肝脏脂质积累。其机制可能是杜仲叶提取物降低肝脏脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，FAS）和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA，HMG-CoA）还原酶及肉碱棕榈酰转移酶（Carnitine Palmitoyltransferase 1A，CPT-1A）活性，通过抑制肝脏脂肪酸和胆固醇的生物合成，增加肝脏脂肪酸β氧化，减少肝脏脂质积累。有研究表明[18]，NAFLD 患者血清中ALT 升高最常见，常伴有AST 升高。该研究通过制备杜仲叶提取物，检测杜仲叶提取物中主要成分，对杜仲叶提取物主要成分进行抗NAFLD研究。实验结果显示，杜仲叶所含主要成分为绿原酸、杜仲苷、京尼平苷酸和车叶草苷，其中京尼平苷酸的含量较高。油红O 染色结果显示，杜仲叶四种主要成分能不同程度降低细胞内脂质含量，京尼平苷酸的效果最好。绿原酸、杜仲苷、京尼平苷酸和车叶草苷能不同程度降低细胞内TG、TC、LDL-C 的含量，其中京尼平苷酸效果最好；绿原酸、杜仲苷、京尼平苷酸能明显降低细胞上清液ALT、AST含量，其中京尼平苷酸效果最好。研究结果表明，杜仲叶所含四种主要成分可不同程度改善细胞内脂质含量，其中京尼平苷酸效果最好，可作为杜仲叶中潜在的抗非酒精性脂肪肝活性成分，其作用机制需进一步研究，且该研究对促进我国杜仲资源可持续发展具有重要意义，值得进一步研究。