HSP47 siRNA对体外培养HTCF细胞生物学行为及TGF-β1表达水平的影响

姚莎莎，盘如刚，甘春芳

0引言

青光眼是常见的致盲眼病，目前主要采用青光眼滤过手术治疗[1]。但手术操作会促进手术周围组织中成纤维细胞的增生，致使滤过通道闭合，导致青光眼滤过手术失败，据统计青光眼滤过手术2a后失败率高达20%[2-3]。目前，常用抗代谢药物抑制青光眼滤过术后手术周围组织的自我修复，但这些药物具有一定的毒副作用，因此寻找毒副作用小且高效的治疗方法和药物是目前研究的热点[4-5]。RNA干扰技术是目前较为先进的技术之一，是利用配对的小片段RNA植入细胞达到阻止同源基因表达的技术[6]。可以利用RNA干扰技术抑制成纤维细胞增生相关蛋白的表达，降低患者术后手术失败率。热休克蛋白47(heat shock protein47，HSP47)属于热休克蛋白家族，参与组织器官纤维化的生理病理过程[7]。近年来研究发现，相较于正常人群，胶原异常增生性疾病患者的HSP47阳性表达水平异常升高，如病理性瘢痕、梭形细胞脂肪瘤等[8]。而青光眼滤过手术后Tenon囊的愈合与病理性瘢痕有极大的相似之处，因此，推测HSP47与青光眼滤过手术后Tenon囊的愈合有着一定的关联。本文将探究HSP47 siRNA对体外培养人眼Tenon囊成纤维(HTCF)细胞生物学行为及TGF-β1表达水平影响，以期为临床防控青光眼滤过手术治疗失败提供实验数据。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要细胞人眼Tenon囊成纤维细胞购自中国科学院细胞库。

1.1.2主要试剂与仪器Lipofectamine 2000(货号：11668-027，批号：062018)购自美国Invitrogen；Trizol试剂(货号：15596026，批号：18T1905)购自美国Sigma；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI1640培养基购自美国赛默飞世尔科技公司；Bcl-2抗体(货号：sc-56015；批号：20190603)、Bax抗体(货号：sc-70407；批号：20190606)购自美国Santa Cruze Biotechnology；HSP47抗体(货号：ab242006)、Ki67抗体(货号：ab205718)、N-cadherin抗体(货号：ab18203；批号：20190814)、E-cadherin抗体(货号：ab194982；批号：20191011)购自美国Abcam；Transwell小室购自美国Corning Coseter；光学显微镜(型号：BX50)购自日本Olympus；流式细胞仪(型号：Attune NxT)购自美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及传代取出保存在液氮罐中的HTCF细胞，置于37℃的恒温水浴中解冻，放入离心机中以1000r/min离心5min，使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基悬浮细胞，置于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞融合到约90%时，去除旧的培养液使用PBS冲洗，消化细胞进行传代培养，取生长状况良好的细胞进行下列实验。

1.2.2 HSP47 siRNA重组质粒的构建根据siRNA的设计原则选择碱基序列，正义链：5’-ACCTCGCCACACTGGGATGAG AAATTTCAAGAGAATTTCTCATCCCAGTGTGGCTT-3’反义链：5’-CAAAAAGCCACACTGGGATGAGAAATTTCTCTTGAAATTTCTCACCCAGTGTGGCG-3。通过合成核苷酸序列的稀释，核苷酸的退火，目的基因与载体的连接，重组质粒的转化，重组质粒的抽提步骤构建HSP47 siRNA重组质粒并通过酶切鉴定和测序鉴定对重组的质粒进行鉴定。

1.2.3重组质粒及分组转染前将HTCF细胞在CO2细胞培养箱中培养生长汇合至90%～95%，测定质粒DNA浓度达标后，经Lipofectamine 2000试剂盒将重组的质粒转染HTCF细胞，并分为：空白对照组、空载体组和转染组。转染组根据HSP47基因序列设计并合成干扰siRNA序列，构建载体并导入HTCF细胞中；空载体组导入空白载体。

1.2.4 RT-PCR检测HSP47 mRNA水平取上述培养的HTCF细胞，使用恒温离心机在4℃的恒温条件下离心10min，后加入Trizol溶液提取总RNA，经逆转录反应合成cDNA链，再以cDNA链为模板，通过实时荧光定量PCR仪进行扩增。以GAPDH为内参，计算HSP47 mRNA的相对水平，实验重复3次。

1.2.5蛋白质印记实验检测蛋白表达取上述培养的HTCF细胞，使用恒温离心机在4℃的恒温条件下离心10min，后加入裂解液裂解后提取总蛋白，测定蛋白浓度后混入Loading Buffer缓冲液，水浴变性10min。电泳分离提取的蛋白样品，再转移到PVDF膜，浸于5%脱脂奶粉中室温下孵育2h，再加入一抗液(1∶1000)中，4℃下孵育过夜。接着加入二抗液(1∶8000)中，37℃孵育1h，最后暗室曝光显影。计算目的蛋白条带灰度值/内参蛋白GAPDH条带灰度值比值，表示目的蛋白的相对表达量，实验重复3次。

1.2.6克隆形成实验检测细胞增殖取上述培养的HTCF细胞，制备1×105/mL单细胞悬液接种于六孔板，正常培养2wk，显微镜下观察是否有肉眼可见的克隆形成，再滴加结晶紫染液染色并拍照，计算克隆形成率(克隆数/所种细胞数×100%)。

1.2.7流式细胞仪检测细胞凋亡取上述培养的HTCF细胞，以1 000r/min离心5min，充分混匀100μL Binding Buffer、5μL Annexin V-FITC和5μL PI，悬浮细胞；室温避光孵育15min后，再次加入400μL的Binding Buffer混匀后，检测细胞凋亡情况，细胞凋亡率(%)=(凋亡细胞数/所种细胞数)×100%。

1.2.8 Transwell法检测细胞侵袭以5μg matrigel均匀包被Transwell小室，调整细胞量2×105个/孔接种于上室，下室添加含有20%胎牛血清的培养基，正常培养24h，去除小室中膜内侧表面多余的细胞，固定于多聚甲醛中，结晶紫染色后，随机选取10个视野，观察并计数染色细胞(侵袭细胞)数目平均值。实验重复检测3次。

1.2.9划痕实验检测细胞迁移取上述培养的HTCF细胞，制备1×105/mL单细胞悬液接种于六孔板，正常培养24h，用1mL枪头垂直于培养孔中央划线，100倍显微镜下拍照并测量0h“划痕”宽度，继续培养24h后再次拍照并测量“划痕”宽度，细胞愈合率=(0h“划痕”宽度-24h“划痕”宽度)/0h“划痕”宽度×100%，实验重复检测3次。

统计学分析: 采用统计学软件SPSS22.0，多组间比较使用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；检验水准α=0.05。

2结果

2.1 HSP47 siRNA对HTCF细胞中HSP47表达的影响由RT-PCR和蛋白质印迹实验可以看出，相比空白对照组，空载体组HSP47 mRNA和蛋白相对表达水平差异均无统计学意义(t=0.484，P=0.645；t=0.753，P=0.480)；相比空载体组，转染组HSP47 mRNA和蛋白相对表达水平均显著降低(t=6.133，P<0.001；t=5.017，P<0.001)，见图1和表1。

2.2沉默HSP47对HTCF细胞增殖影响由克隆形成实验和蛋白质印迹实验可以看出，相比空白对照组，空载体组克隆形成率和Ki67蛋白相对表达水平差异均无统计学意义(t=1.034，P=0.341；t=0.351，P=0.737)；相比空载体组，转染组克隆形成率和Ki67蛋白相对表达水平均显著降低(t=9.072，P<0.001；t=11.938，P<0.001)，见图2，表2。

图1 HSP47 siRNA对HTCF细胞中HSP47蛋白表达的影响。

图2 沉默HSP47对HTCF细胞增殖影响 A：克隆形成实验拍照(×100)；B：增殖相关蛋白Ki67表达情况。

图3 沉默HSP47对HTCF细胞凋亡影响 A：流式细胞仪检测细胞凋亡情况；B：凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达情况。

表1 HSP47 siRNA对HTCF细胞中HSP47表达的影响

表2 沉默HSP47对HTCF细胞增殖影响

表3 沉默HSP47对HTCF细胞凋亡影响

2.3沉默HSP47对HTCF细胞凋亡影响由流式细胞仪检测细胞凋亡和蛋白质印迹实验可以看出，各组细胞凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白相对表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见图3，表3。

2.4沉默HSP47对HTCF细胞侵袭及迁移影响由划痕实验和Transwell小室实验可以看出，相比空白对照组，空载体组细胞愈合率(t=0.375，P=0.721)、E-cadherin(t=0.470，P=0.655)和N-cadherin蛋白相对表达水平(t=0.773，P=0.469)、单位面积侵袭细胞数目(t=0.561，P=0.595)差异均无统计学意义；相比空载体组，转染组细胞愈合率(t=3.197，P=0.019)、N-cadherin蛋白相对表达水平(t=3.382，P=0.015)、单位面积侵袭细胞数目(t=4.854，P=0.003)均显著降低，E-cadherin蛋白相对表达水平显著升高(t=5.639，P=0.001)，见图4，表4。

图4 沉默HSP47对HTCF细胞侵袭迁移影响 A：划痕实验拍照图(×100)；B：迁移相关蛋白E-cadherin和N-cadherin蛋白表达情况；C：Transwell小室检测结果(×400)。

表4 沉默HSP47对HTCF细胞侵袭迁移影响

图5 沉默HSP47对HTCF细胞TGF-β1表达水平影响。

2.5沉默HSP47对HTCF细胞TGF-β1表达水平影响三组TGF-β1蛋白相对表达水平比较，差异有统计学意义(F=13.982，P=0.006)。相比空白对照组(0.78±0.15)，空载体组TGF-β1蛋白(0.81±0.10)相对表达水平差异均无统计学意义(t=0.323,P=0.758)；相比空载体组，转染组TGF-β1蛋白(0.37±0.09)相对表达水平显著降低(t=4.732,P=0.003)，见图5。

3讨论

青光眼滤过手术失败的机制较为复杂，其中HTCF细胞的过度增殖是重要因素之一[9]。Ki67是一种常见的调控细胞增殖的蛋白，可维持DNA结构的稳定，并促进细胞有丝分裂，其表达水平越高细胞增殖能力越强[10-11]。本研究通过克隆形成实验发现，HSP47 siRNA可以抑制HTCF细胞的增殖。为了探究其机制，本研究进一步采用蛋白质印迹实验检测了Ki67的水平发现，相比空载体组，转染组克隆形成率和Ki67蛋白相对表达水平均显著降低。说明HSP47 siRNA可以通过抑制增殖相关蛋白的表达实现抑制HTCF细胞的增殖。

HTCF属于结膜下结缔组织，在受到手术创伤刺激下成纤维细胞就会发生转分化而形成肌成纤维细胞，激活了整个瘢痕反应[12]。其中细胞的凋亡就会促进整个反应，细胞的凋亡受到相关基因的调控，如Bcl-2家族蛋白，该家族中主要包括：Bcl-2蛋白和Bax蛋白，其中Bcl-2是一种抗凋亡基因，Bax是一种凋亡基因，Bcl-2/Bax平衡的变化是促进或抑制细胞凋亡的重要信号[13-14]。本研究发现，HSP47 siRNA对细胞的凋亡及相关蛋白表达水平并没有影响。说明沉默HSP47确实对HTCF细胞的凋亡无影响。

细胞外基质中瘢痕组织的过多聚集也是导致青光眼滤过手术失败的重要因素之一[15]。HTCF细胞的运动能力增强可以促进细胞外基质中瘢痕组织的聚集，故抑制HTCF细胞的运动能力可以一定程度上防止细胞外基质中瘢痕组织的聚集。上皮间质转化(epithelial mesenchyml transition，EMT)是调节细胞运动能力的重要机制[16]，上皮细胞暂时极性的丧失将导致细胞获得间质细胞移动能力[17-18]。同时，E-钙黏蛋白(E-cadherin)对于细胞连接、维持细胞正常结构有重要作用，E-cadherin表达下调，将增强细胞的侵袭能力[19-20]。本研究中，转染组细胞的侵袭和迁移能力受到了显著的抑制。随后采用蛋白质印迹实验发现，转染组细胞中N-cadherin表达降低，E-cadherin表达升高。说明HSP47 siRNA可以通过调控HTCF细胞的EMT过程实现抑制其运动能力，故沉默HSP47表达可减少细胞外基质中瘢痕组织的过多聚集。

TGF-β1是一种多肽类生长因子，是目前为止研究最为广泛的纤维化因子[21]。TGF-β1可以促进成纤维细胞的增殖，同时还能诱使成纤维细胞的分化，促进前胶原的合成。青光眼滤过手术后，若手术周围瘢痕组织的过多聚集，将引起手术区域瘢痕性愈合，最终导致手术失败[22-23]。本研究检测了HTCF细胞中的TGF-β1含量水平发现，相比空载体组，转染组TGF-β1蛋白相对表达水平显著降低。说明沉默HSP47可以有效抑制TGF-β1蛋白的表达，防止手术后区域瘢痕性愈合导致手术失败。这可能是因为HSP47 siRNA抑制了TGF-β1促进胶原合成的作用，缓解了细胞外基质中瘢痕组织的聚集。Zhu等[24]研究表明：通过RNA干扰技术可以有效抑制TGF-β1的合成，抑制HTCF细胞的增殖和成纤维细胞的形成，本研究得出的结论与其相一致。

综上所述，HSP47 siRNA可以抑制TGF-β1促进HTCF细胞的增殖、侵袭及迁移能力，但对HTCF细胞的凋亡无明显影响。