β2-肾上腺素受体色谱模型的建立及在止咳平喘药筛选中的应用

＊尚丛珊 侯亚妮

（西安培华学院 陕西 710025）

随着社会快速发展，空气质量与日下降，呼吸系统疾病尤其是支气管哮喘，发病率逐渐上升。支气管哮喘的防治指南中明确指出，控制哮喘发作是治疗支气管的主要目的[1]。临床治疗药物包括β2-AR激动剂、糖皮质激素、茶碱类和抗胆碱类药物等，其中β2-AR激动剂能与呼吸系统平滑肌上的β2-AR结合，消除气管痉挛，被广泛用于治疗急性支气管哮喘。但是，现有治疗方法中激素类药物使用较多，存在不良反应大、费用高等问题。

中药在我国具有历史悠久，疗效显著、副反应小且资源丰富的特点，利用价值较高，已经成为开发高效创新药物的主要选择，但是其成分复杂，临床用药辩证灵活，因此，活性成分筛选成为药物开发的关键因素[2]，中药活性成分筛选也是药学研究的热点领域。

β2-肾上腺素受体（β2-AR）是G-蛋白偶联受体家族的一员，分布于平滑肌中，能够与儿茶酚胺类物质或受体激动剂、拮抗剂相作用，引起舒张血管、松弛平滑肌、扩张支气管、分解肝糖元等一系列生理反应[3-4]。肺部β2-AR接受刺激可引起气道平滑肌放松，常被作为止咳平喘药发挥作用的主要靶受体[5]。本文在实验室前期研究的基础上，将受体与药物作用的特异性和色谱技术相结合，建立β2-肾上腺素受体色谱模型，研究其在止咳平喘药活性成分筛选中的应用。

1.肾上腺素受体

受体因其独特的优势，在生物学检测和药物筛选等方面逐渐被重视，肾上腺素受体（AR）是G-蛋白偶联受体家族的一员，包括α-肾上腺素受体和β-肾上腺素受体（α-AR和β-AR）[6]。随着对肾上腺素受体的深入研究，人们又发现不同肾上腺素受体的解剖定位和功能特性在机体内各有差异，分布于平滑肌组织和肺组织的β2-AR对肾上腺素的敏感性更高[7-8]，可以介导血管和平滑肌的扩张，分布于脂肪细胞的β3-AR对调节释放瘦蛋白起重要作用[9]。

(1)β2-肾上腺素受体的结构

β2-AR分子量约64KD，有3个糖基化位点和2个额外的螺旋肽，7次跨膜结构经过螺旋折叠形成“口袋”状配基结合位点。靠近胞外环的跨膜和第二胞外环处是药物的主要结合位点[10]，靠近胞内的跨膜氨基酸和胞内环可结合G蛋白并参与信号转导[11]。细胞膜上β2-AR以单体或者二聚体形式动态平衡地存在，表达水平相对稳定，与膜上蛋白结合位点相互作用，单体形式即能保证功能发挥，与配体以1:1结合[12]。

(2)β2-肾上腺素受体的功能

β2-AR依靠偶联蛋白（G蛋白）和腺苷酸环化酶（AC）联合作用发挥效应，儿茶酚胺类与受体作用后，激活G蛋白，并将信息传递给效应器腺苷酸环化酶，促使细胞内产生CAMP。β2-AR与G蛋白偶练位点主要位于其跨膜域中，与激动剂连接后腺苷酸环化酶即被激活，使CAMP浓度升高，诱发一系列生化反应，从而发挥生理效应。

2.β2-肾上腺素受体分离纯化的研究

建立受体色谱模型中，获得高纯度的受体是构建模型的基础。目前获得β2-AR的方法主要包括真核、原核细胞及无细胞系统表达，利用基因工程技术进行蛋白的分离纯化具有操作简单、省时省力、纯化效果好的特点，且蛋白的生物活性不受影响。本实验主要采用原核细胞表达，将人源β2-AR目的基因重组至环状质粒，并转染至大肠杆菌中诱导表达，获得目的菌并纯培养，收获菌体细胞，超声破碎，获得含β2-AR的上清液，经亲和层析和阴离子交换柱，收集纯化蛋白，经SDS-聚丙烯酰胺-考马斯亮蓝鉴定所得蛋白即为目的蛋白。

3.β2-肾上腺素受体色谱模型的建立

(1)生物色谱法

传统β2-AR色谱法是指将特定的受体固定于载体上，用常规分析方法挑选试剂。而出现于20世纪80年代中后期的生物色谱法则是将色谱分离技术和生命科学结合起来，利用药物通常与靶点即生物大分子包括酶、受体、通道蛋白等结合产生效应的原理[13]。采用细胞膜、酶、仿生物膜等生物活性材料做固定相，能与各种生物活性物质特异性结合，应用于药物活性成分的筛选和药理研究，使药物有效成分的分离与筛选相结合，实现化学成分-效应-作用机理联动的药物研究新方法，尤其适合天然药物的研究。

生物色谱法将活性生物大分子、细胞膜等键合于色谱载体上，根据固定相不同，该法可分为分子生物色谱法、生物膜色谱法、仿生物膜色谱法和细胞生物色谱法等[14]。该实验中采用的则是较为成熟的分子生物色谱法。

(2)β2-肾上腺素受体色谱

β2-AR色谱以受体作为配基，依靠其特异性进行药物活性成分研究，可实现中药活性成分筛选、分离和结构鉴定一体化分析，具有稳定性高、灵敏性高的特点。相比于传统色谱技术，受体色谱载体固定方式特定，可较好地确保实验效果，且使用的载体为硅胶，稳定性较好，可重复利用，其次，该方法能优化和调节固定受体的方向和构象，可最大化实现受体-药物相互作用，可用于中药复杂成分的高效靶向筛选和快速分析[15]。

基于该优势，利用本实验室研究基础制备氨丙基硅胶作为载体，并将纯化所得的β2-AR键合于该载体，采用湿法填装色谱柱，所得即为β2-肾上腺素受体色谱模型。经工具药硫酸沙丁胺醇、酚妥拉明、普萘洛尔等工具药进行保留特性研究，证明该β2-AR色谱模型生物活性、稳定性和特异性均良好，可用于研究受体与药物的相互作用及筛选中药药物活性成分。

4.β2-肾上腺素受体色谱模型在止咳平喘药活性成分筛选中的应用

研究发现，中医止咳平喘多以黄芩、桑白皮、麻黄、杏仁等药作为优选中药。黄芩主入肺经，善清泻肺火，多用于治疗肺热咳嗽气喘、痰稠痰多；桑白皮清热泻肺，用于治疗伏火郁肺，肺热喘逆，肝火犯肺等症；麻黄主入肺经，宣肺止咳平喘，同时还可防寒气太过；杏仁具有止咳平喘、降气的功效，这些均是我国传统中药，在治疗呼吸系统疾病中可发挥重要作用。本实验以此为基础，将以上中药作为对象，实验室水煎提取，制备浓缩药液，利用β2-肾上腺素受体色谱模型进一步验证药物中的有效成分。在拟定色谱条件下进行筛选，发现黄芩、麻黄、杏仁提取液在β2-肾上腺素受体色谱柱上均有色谱保留峰出现，表明其含有可与β2-AR相作用的活性成分。

5.结论

本文通过对肾上腺素受体及β2-AR结构的分析，了解其主要功能。利用基因重组技术获得β2-AR，结合生物色谱法的构建原理，建立β2-肾上腺素受体色谱模型，并验证该模型生物活性、稳定性和特异性。利用该模型对黄芩、桑白皮、麻黄、杏仁等药物中药效成分进行初步验证，结果表明，黄芩、麻黄、杏仁中含有可与β2-AR相作用的成分，该模型能够在中药活性成分筛选中发挥一定作用，为接下来药效成分的筛选鉴定提供参考价值。