OsALS S627N是一个新的转基因植物筛选标记基因

张红磊 李军玲 张融雪 郭彦丽 刘静妍 苏京平 佟 卉 刘燕清 王胜军 孙 玥

(天津市农作物遗传育种重点实验室(天津市农作物研究所)，天津 300384)

生物遗传转化所构建的表达载体中常常插入了便于筛选用的标记基因。在遗传转化之后，植物表达载体上所有的插入序列一起整合到受体植物染色体基因组中。表达载体上的选择标记基因的产物能使成功转化的细胞产生抗性而存活，未转化的细胞则不能生长。所以此方法能够从大量的细胞及组织筛选出转化细胞及植株，是一种比较方便、快速的转基因植物鉴定方法。而目前最常用的选择标记基因主要有2大类：抗生素抗性酶基因和抗除草剂抗性酶基因。抗生素抗性酶基因可产生对某种抗生素有抗性的物质，而抗除草剂抗性酶基因可产生对相应除草剂有抗性的物质。转化成功的细胞可以在含有抗生素或除草剂的培养基上正常生长。在生物遗传转化中抗生素抗性酶基因有nptⅡ基因(产生新霉素磷酸转移酶，抗卡那霉素和新霉素等)、hpt基因(产生潮霉素磷酸转移酶，抗潮霉素)和gent基因(产生庆大霉素乙酰转移酶，抗庆大霉素)等。在这些抗生素抗性基因中，潮霉素因高效和低假阳性常被用于多种物种如：植物[1-2]、酵母[3]、真菌[4-5]、动物[6]的遗传转化中。而抗除草剂基因有epsp基因(产生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘膦)、bar基因(产生草丁膦乙酰转移酶，抗草丁膦或草甘膦)等[7]，这些筛选标记虽然常用，但是使用成本较高。ALS是植物和微生物合成支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)的关键酶，动物和人没有该酶，是理想的除草剂靶标。通过前期研究发现水稻ALS基因突变型OsALSS627N对咪唑啉酮类除草剂有良好抗性，所对应的咪唑咪酮类除草剂[8]与其相比较便宜，咪唑咪酮类除草剂具有高效、杀草谱广、高选择性和对人畜高度安全等优点。

1 材料和方法

1.1 实验材料

(1)材料：水稻品种“选1”材料中的ALS基因，1880位点发生突变，由原有的T变为G(已克隆)；生态型Columbia-0拟南芥。

(2)菌种：大肠杆菌DH5α、农杆菌EHA105均为本实验室保存。

1.2 实验方法

1.2.1ALS基因的克隆与鉴定

ALS基因全长为1 935 bp，GC含量高，并且分布极不对称。沿着ALS的转录方向，GC含量逐渐降低。在ALS基因的5’末端的500 bp，GC含量高达76.5%，而3 7末端的300 bp，GC含量则在50%。对于高GC含量或低GC含量的区域，在做PCR时不容易扩增，再加上ALS基因的上述特点，使得ALS基因的克隆难度进一步增加。针对ALS基因难以克隆这一难题，本文设计了多对引物。实验前期采用多对引物进行了PCR条件的摸索，但一直没能扩增出目的条带。所以对ALS基因的克隆采取了套式PCR(又称巢式PCR)的策略，即在基因的外侧设计一对外侧的引物，可扩增出长于基因全长的片段，并且完整的目的基因包含在扩增的长片段中。第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。期望通过套式PCR来提高ALS基因的特异性扩增。

1.2.2 过表达载体的构建

将用内侧引物ALS-F3、ALS-R5进行PCR扩增得到的2 000 bp左右的目的ALS基因条带，用凝胶回收试剂盒回收该片段后，将ALS基因克隆到pEASY-T1 Simple vector载体上，得到pT-ALS，质粒pT-ALS用Bgl II、Nde I双酶切后得2 000 bp左右的ALS基因条带。载体pEXP-35S-TP-PA用Bgl II、NdeI双酶切(分步酶切)去掉TP后，经凝胶电泳切胶回收后，与胶回收的ALS基因通过连接酶连接，得到质粒pEXP-35S-ALS-PA。用限制性内切酶kpnI和Xba I共同对pEXP-35S-ALS-PA和pCAMBIA 1301载体进行双酶切，将pEXP-35S-ALS-PA双酶切后的片段表达盒35S-ALS-PA和pCAMBIA 1 30 1双酶切后的大片段利用Axygen公司的琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒进行回收纯化，并利用T4连接酶进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞后，获得转化子1301-ALS。将该载体转化农杆菌Eha105， 用于遗传转化。

1.2.3 拟南芥的转化

拟南芥种子消毒之后在4 ℃下春化3 d。而后将种子铺于1/2 MS 培养基上(含糖为1%，pH为6.2)。培养条件为(21±1) ℃，光照周期16 h光照/8 h黑暗，培养条件为(21±1) ℃。14 d后将长出的幼苗移入营养土内进行培养。待拟南芥开花之后用10 mL 5%的蔗糖溶液重悬农杆菌菌体，并加0．05%的Silwet L．77溶液对拟南芥进行侵染，侵染24 h之后的拟南芥在16 h光照/8 h黑暗条件下培养。

1.2.4 转基因植株的分子鉴定及纯合体的筛选

分子鉴定所用的引物为35：GAGGACCTAACAGAACTCGCCG，GUS-R：TCGCGATCCAGACTGAATGCC 。获得的T0代的转基因拟南芥的种子消毒后铺种在的MS培养基(含有潮酶素抗性)上。将经抗性筛选长成的植株，提取基因组DNA，进行PCR，收取PCR阳性植株的种子。T1代种子单棵收取阳性植株的种子。同理收T2代种子。单棵收取的T2代种子，选取T3代的种子铺种在培养基上(含有潮酶素抗性)，如果均为抗性苗，则为纯合体植株。收取纯合体植株种子，用于后续实验。

2 结果与分析

2.1 拟南芥转基因株系的获得及鉴定

本实验室首先将“选1”ALS构建到pCAMBIA 1301上，之后提取pCAMBIA 1301-ALS质粒，再将其质粒对农杆菌Gv3101进行转化，成功得到了Gv3101．pCAMBIA 1301-ALS菌株，之后用浸花法对拟南芥进行了转化后收种。用潮霉素从T0ALS拟南芥种子中重新筛选得到10个株系，提取其DNA，用引物(35SF：GAGGACCTAACAGAACTCGCCG，GUS-R：TCGCGATCCAGACTGAATGCC)进行PCR鉴定，结果如图1所示。

图1 PCR鉴定结果

泳道M：DNA标准分子量15 000 bp；泳道1：WT；泳道2：pCAMBIA 1301-ALS质粒。

泳道3：T0ALS1；泳道4：T0ALS2；泳道5：T0ALS3；泳道6：T0ALS4。

泳道7：T0ALS5；泳道8：T0ALS6；泳道9：T0ALS7；泳道10：T0ALS8。

泳道11：T0ALS9；泳道12：T0ALS10。

结果表明，10个株系除了T0ALS7均得到了正确的条带。则T0ALS1-6、8-10均为转基因株系。利用潮霉素(30 mg/L)对以上9个株系继续进行纯合体植株的筛选实验，结果如表1所示。

表1 潮霉素筛选结果

选取抗性比例接近3∶1的进行纯合体的筛选实验，得到6株纯合体株系(标记为5-2、5-4、5-5、5-9、6-1、6-4和6-9)，用于后续除草剂筛选质量浓度的摸索。

2.2 拟南芥纯合体株系的咪唑啉酮类除草剂甲氧咪草烟筛选浓度摸索

图1材料中的ALS基因具有咪唑啉酮类除草剂的抗性，对于得到纯合体株系可以用甲氧咪草烟(咪唑啉酮类除草剂)进行测定，除草剂的质量浓度初步设定为0、0.25、0.5、0.75、1 mg/L 5个质量浓度梯度，分别对WT株系和纯合体株系进行处理，处理结果如图2所示。

由图2可见，WT与纯合体株系在0 mg/L条件下生长正常，WT与纯合体株系于0.25 mg/L处理下出现了显著明显的生长抑制，当处理质量浓度更高时WT与纯合体株系均生长抑制，推测处理质量浓度太高导致WT与纯合体株系不生长，所以降低处理质量浓度继续进行除草剂质量浓度摸索实验。

图2 纯合体株系拟南芥7 d的除草剂处理结果

降低除草剂的质量浓度继续对纯合体株系进行除草剂处理，本次设计的除草剂质量浓度为0、0.005、0.01、0.05、0.1 mg/L处理7 d，结果如图3所示。

图3 纯合体株系拟南芥7 d的除草剂处理结果

由图4可见，WT与纯合体株系在0mg/L条件下生长正常，当处理质量浓度为0.005 mg/L时下WT与纯合体株系的生长均受到一定抑制，但对WT和纯合体株系的抑制程度的差异达到极显著水平，当处理质量浓度为0.01 mg/L时对WT抑制程度比对纯合体株系抑制程度更明显达到极显著水平。而当质量浓度更高时对WT的抑制更为明显，但WT和纯合体株系的抑制程度差异达到极显著水平，从图2、4中可以确定甲氧咪草烟的筛选质量浓度为0.01 mg/L。

图4 除草剂浓度对拟南芥根长的影响

2.3 咪唑啉酮类除草剂甲氧咪草烟对转基因拟南芥的筛选

利用甲氧咪草烟对T0ALS1-6、8-10等9个株系进行筛选实验，其筛选质量浓度为0.01 mg/L，结果如表2所示。

表2 甲氧咪草烟筛选结果

与潮霉素筛选结果相比，甲氧咪草烟筛选出的阳性率基本与其持平，因此OsALSS627N可以作为筛选标记来筛选阳性转基因植株。

2.4 转基因拟南芥GUS染色鉴定

因1301载体上有GUS基因，所以可以对转基因拟南芥进行GUS染色鉴定，以确定甲氧咪草烟筛选出的阳性转基因植株，结果如图5所示。

图5 GUS染色鉴定

由图5可知T5和T6这2个纯合体株系均有GUS染色结果，而WT未染上颜色，这说明这甲氧咪草烟筛选出的这2个株系确为转基因拟南芥。

3 讨论

研究发现，当咪唑啉酮类除草剂甲氧咪草烟的质量浓度为0.01 mg/L时，就能够有效筛选出阳性转基因植株，而潮霉素所需的质量浓度为30 mg/L，所以OsALSS627N可以作为拟南芥转化中的筛选标记。对于此筛选标记能够作为其他植物的筛选标记以及筛选质量浓度，需要进一步研究。另外，该标记也有其局限性，就是对本身具有咪唑啉酮类除草剂抗性植物是无效的。