刺梨果渣中蔷薇酸的提取工艺研究

刘英枭，袁小红

（西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳 621000）

刺梨（Rosa roxbunghii Tratt.）为蔷薇科多年生落叶灌木缫丝花的果实，又名山王果、刺莓果、茨梨等，是一种滋补养身、稀有的营养珍果［1-3］。刺梨作为贵州省特色食品资源，含有丰富的维生素、黄酮、三萜、多糖类化合物。每100 g 刺梨果肉中含有2 500 mg左右的维生素C，是苹果、梨等含量的500 倍，被称作“VC 之王”［4］。有研究表明，野生刺梨中总黄酮含量为0.746%，总三萜含量为2.578%［5］。贵州省刺梨集中连片种植面积约10 万hm2，种植规模全国第一。据贵州日报报道，贵州省预计到2021 年刺梨种植面积在现有基础上将新增4 万hm2，年产鲜果50 万t，综合产值达到100 亿元［6］。目前来看，刺梨果渣的利用度较低，以刺梨提取物制造药品，可以大大提高刺梨的利用度，实现刺梨产品常态化［7］。

五环三萜类化合物是以6 个异戊二烯构成的萜类化合物，在自然界中分布广泛［8］。刺梨中含有大量的五环三萜酸，如齐墩果酸、熊果酸、蔷薇酸［9，10］等。它们均具有多种重要的生物活性，如抗炎［11］、抗肿瘤［12，13］、保肝护肝［14-16］、治疗胃溃疡［17］等。

目前从刺梨中提取黄酮、三萜类化合物常用方法为超声提取、微波辅助提取、水浴提取等［18-20］。查阅文献未发现有通过碱提酸沉法从刺梨中提取五环三萜类化合物的方法，也没有关于用响应面法优化刺梨中蔷薇酸提取工艺的研究报道。碱提酸沉法相对于传统提取方法节约成本、对环境友好。本研究以蔷薇酸得率为目标值，采用单因素试验和响应面试验研究刺梨果渣中蔷薇酸的提取工艺，旨在为蔷薇酸的工业化生产提供参考依据。（表1）。提取液经抽滤、减压浓缩，用80%乙醇溶解，溶液经微孔滤膜过滤后按“1.3.2”方法测定后计算蔷薇酸得率。

表1 单因素试验设计

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜刺梨购自贵州省六盘水市刺梨种植基地，经西南科技大学袁小红教授鉴定为蔷薇属植物刺梨。

1.2 仪器与试剂

榨汁机，九阳电器有限公司；电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；R-210 型旋转蒸发仪，瑞士BUChI 公司；SHB-Ⅲ型循环水式真空泵，郑州长城科工贸公司；高效液相色谱仪，Agilent Technol⁃ogies Inc.。

蔷薇酸标准品，滁州仕诺达生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱为ZORBAX Eclipse XDBC18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇+0.5%磷酸水溶液（80∶20）；柱温35 ℃；检测波长210 nm；流速1 mL/min；进样量10 μL。

1.3.2 蔷薇酸标准曲线 准确称取1 mg 蔷薇酸标准品，用1 mL 甲醇超声溶解于离心管中，稀释配制质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的标准溶液。分别取各浓度标准品10 μL 注入色谱仪，在“1.3.1”的色谱条件下测定，得到标准品的高效液相色谱。以标准品浓度（mg/mL）为横坐标、色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得标准曲线回归方程：y=9 629.4x-7.539 5，R2=0.999 8，线性范围0～1.0 mg/mL。蔷薇酸得率计算公式如下。

式中，m1为刺梨果渣粉末的质量，g；m2为蔷薇酸的质量，g。

1.3.3 提取工艺研究

1）单因素试验。准确称取0.6 g 刺梨果渣粉末于20 mL 试管内，加入一定比例、一定pH 的碱液，设置水浴锅温度进行提取（以上试验均设置3 个重复）

2）响应面试验。使用Design Export 8.0 软件中的Box-Behnken 中心组合设计优化提取条件（表2），在单因素试验基础上，考察提取温度、碱液pH、液固比3 个因素对响应值得率的影响。1.3.4 纯化工艺研究

表2 响应面试验因素与水平

1）酸沉pH单因素试验。准确称取5份刺梨果渣粉末于试管中，每份0.6 g，加入12 mL 碱液调pH 至12，水浴锅70 ℃提取120 min，提取2 次，过滤收集滤液，用酸沉将滤液pH 调到5、4、3、2、1。减压浓缩后用相同体积80%无水乙醇溶解，微孔滤膜过滤后按“1.3.2”方法测定并计算蔷薇酸质量（设置3次重复）。

2）乙酸乙酯萃取次数单因素试验。准确称取3份刺梨果渣粉末，每份0.6 g，在单因素最优条件下提取。提取液抽滤，HCl 水溶液调pH 至2，用1 倍体积乙酸乙酯分别萃取1、2、3 次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩后称重（设置3 次重复）。

3）乙酸乙酯萃取比例单因素试验。准确称取3份刺梨果渣粉末，每份0.6 g，在单因素最优条件下提取。提取液抽滤，HCl 水溶液调pH 至2，用0.5、1.0、1.5、2.0 倍体积乙酸乙酯分别萃取2 次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩后称重（设置3 次重复）。

4）蔷薇酸纯化得率。纯化后蔷薇酸纯化得率计算公式如下。

式中，m3为蔷薇酸质量，g；m4为乙酸乙酯萃取质量，g。

2 结果与分析

2.1 提取工艺单因素试验结果

从单因素试验结果（图1 至图5）可知，当液固比为15∶1（mL∶g）、提取时间120 min、提取温度70 ℃、碱液pH 为12、提取2 次（综合环保及得率考虑）时提取液中蔷薇酸得率最高。

图1 碱液pH 对蔷薇酸得率的影响

图2 液固比对蔷薇酸得率的影响

图3 提取温度对蔷薇酸得率的影响

图4 提取次数对蔷薇酸得率的影响

图5 提取时间对蔷薇酸得率的影响

2.2 响应面法优化试验结果

2.2.1 模型建立及显著性检验 通过对试验数据进行二次回归分析，得出多项式回归方程如下：Y=0.26+0.017A+0.035B+0.008 938C+0.006 050AB+0.008 025 AC+0.004 3BC-0.043A2-0.051B2-0.015C2，式 中Y 为蔷薇酸得率，A、B、C 分别为提取温度、碱液pH 和液固比。

响应面法试验结果见表3，对此模型进行方差分析（表4），模型F 值是94.91，且P<0.01，表明建立的模型极显著；失拟项P>0.05，回归方程可代替实点对试验结果进行分析，模型的决定系数R2=0.991 9，表明模型拟合度良好，可以准确预测蔷薇酸得率，信噪比28.597>4，表明回归方程可信度较高，该模型可用于理论预测优化刺梨果渣中蔷薇酸的提取工艺。

模型的线性系数（A、B、C）、二次项系数（A2、B2、C2）和交互项（AC）的P<0.05，表明对蔷薇酸得率有显著影响。3 个因素对蔷薇酸得率的影响大小次序为碱液pH>提取温度>液固比。

2.2.2 响应面交互作用分析 响应值与各因素的等高线图、三维空间响应面图可直观地展现各因素之间的交互作用对蔷薇酸得率的影响，通过等高线的密集程度判断两因素交互的影响程度［21］。由图6a可知，等高线沿碱液pH 密集，碱液pH 对蔷薇酸得率的影响大于提取温度的影响。由图6b 可知，碱液pH 固定不变时，提高提取温度，蔷薇酸得率先增大后减小；提取温度固定不变，碱液pH 增加，蔷薇酸得率先增加后逐渐减小；由图7a 可知，等高线沿提取温度密集，提取温度对蔷薇酸得率的影响大于液固比；由图7b 可知，提取温度保持不变，增加液固比，蔷薇酸得率基本保持不变，液固比保持不变，增加提取温度，蔷薇酸的得率先增大后减小；由图8a 可知，等高线沿碱液pH 密集，碱液pH 对蔷薇酸得率的影响大于液固比；由图8b 可知，碱液pH 保持不变，增加液固比，蔷薇酸得率基本保持不变，液固比保持不变，增加碱液pH，蔷薇酸得率先增大后减小。综上3个因素对蔷薇酸得率影响为碱液pH>提取温度>液固比。

表3 响应面法试验结果

图6 碱液pH 和提取温度交互作用对蔷薇酸得率的影响

表4 回归模型方差分析

图8 液固比和碱液pH 交互作用对蔷薇酸得率的影响

2.2.3 提取工艺优化及验证 通过Design expert 8.0 软件中Numerical 优化模块得到预测值，给出模型预测最佳提取条件为碱液pH 12.37、提取温度72.55 ℃、液固比17.07（mL∶g），提取时间120 min，提取2 次；在此优化条件下蔷薇酸得率为0.266%。因试验仪器精度限制，采用碱液pH 12，提取温度73 ℃，液固比17（mL∶g），提取时间120 min，提取2次的提取条件进行3 次平行试验，测得蔷薇酸的平均得率为0.257%，RSD 为1.403%，与预测值无显著差异。

2.3 纯化工艺研究

2.3.1 酸沉pH 的选择 由高效液相色谱峰面积计算可得，酸沉pH 为5、4、3、2、1 时蔷薇酸质量分别为（0.349±0.024）、（0.965±0.036）、（1.125±0.038）、（1.329±0.03）、（1.373±0.003）mg。pH 为2 和1 时蔷薇酸质量相差不大，选用pH 为2 的酸沉条件。

2.3.2 乙酸乙酯萃取次数的选择 用乙酸乙酯萃取的方法可以去掉大极性、水溶性杂质。 经计算后可得，乙酸乙酯萃取1、2、3 次的样品乙酸乙酯层减压浓缩后质量分别为（0.031 2±0.000 5）、（0.038 8±0.000 2）、（0.039 3±0.000 6）g。考虑节能环保的因素，选萃取2 次。

2.3.3 乙酸乙酯萃取比例的选择 结果表明，乙酸乙酯萃取液体积比例为0.5、1.0、1.5、2.0 倍时样品乙酸乙酯层减压浓缩后质量分别为（0.035 9±0.000 8）、（0.038 3±0.000 6）、（0.038 8±0.000 4）、（0.039 0±0.000 7）g。考虑节能环保的因素，选萃取体积比例为1.0 倍体积。

3 结论

以蔷薇酸得率为指标，采用单因素和响应面试验优化了提取刺梨果渣粉末中蔷薇酸的工艺条件，最佳试验条件为碱液pH 12、提取温度73 ℃、液固比17︰1（mL︰g），提取时间120 min，提取2 次；经酸沉pH 2、乙酸乙酯1.0 倍体积萃取2 次后蔷薇酸的纯化得率可达3.77%。区别于传统的提取方法，采用碱提酸沉的提取方法，提取工艺简便易行、成本低、几乎零污染，且使用刺梨果渣作为提取对象，大大提高了刺梨的利用度，可为工业化提取分离蔷薇酸提供参考依据。