新疆地区APOE基因多态性与子痫前期相关性分析

陈红艳，段茉莉，张欣文，陈超，颜桦

（1.西北大学生命科学学院国家微检测工程技术研究中心，陕西 西安 710127；2.西安市第四医院妇女保健科，陕西 西安 710016；3.乌鲁木齐市妇幼保健院妇产科，新疆 乌鲁木齐 830001）

子痫前期是典型的妊娠多系统疾病，其特征是由深层血管收缩和凝血级联反应的激活引起的胎盘灌注减少，这些病理生理变化可能与内皮细胞功能障碍有关[1]。脂质和脂蛋白代谢紊乱可能促进氧化应激和血管功能障碍，从而诱发子痫前期的发生[2]。与正常孕妇相比，子痫前期妇女的脂质分布异常，富含甘油三酯（TG）的脂蛋白浓度升高[3]，可能导致内皮功能障碍。由于子痫前期疾病史的家庭发病率更高[4]，因此，某些遗传因素可能参与其病因。目前关于子痫前期的遗传基础仍不清楚。

载脂蛋白E（ApoE）在脂质代谢中发挥重要作用。人类APOE 基因位于染色体19q13.2 上，共含有4 个外显子，主要存在3 个等位基因（APOE ε2，APOE ε3 和APOE ε4），以及6种基因型（E2/2，E2/3，E2/4，E3/3，E3/4和E4/4）。APOE基因多态性导致脂质代谢异常，已知与神经退行性疾病、动脉粥样硬化及其他心血管疾病有关[5-7]。关于APOE基因多态性与子痫前期易感性的关系有很多报道，然而，不同地区的结果并不一致。有文献[8-10]结果表明，APOE基因多态性是子痫前期发生的可能危险因素。然而，也有文献[3，11-15]结果表明APOE 基因多态性与子痫前期发生风险无关，甚至有文献[16]表明APOEε2 等位基因对子痫前期发生有保护作用，因此，APOE基因多态性与子痫前期的关联仍有待了解。本研究通过对新疆地区重度子痫前期、轻度子痫前期和正常人群APOE 基因多态性进行检测，旨在探讨新疆地区APOE 基因多态性与子痫前期发病的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本研究共招募387名女性受试者（280名健康孕妇（正常组）、81例重度子痫前期患者（重度子痫前期组）和26例轻度子痫前期患者（轻度子痫前期组）。2016年1月至2016年10月，所有参与者在新疆维吾尔自治区妇幼保健院接受检查和治疗。子痫前期组选择及诊断标准参照《妊娠期高血压诊治指南（2015）》[17]。正常组纳入标准：妊娠期血压无异常（血压＜140/90 mmHg）；孕妇无慢性高血压、子痫前期、糖尿病、心脏病、肝病和肾病病史；妊娠辅助检查：血/尿常规、肝肾功能正常。本研究经西北大学伦理委员会和新疆维吾尔自治区妇幼保健院伦理委员会批准。获得所有参与者的知情同意。

1.2 样本采集及血脂指标测定 所有受试者于分娩前，基础状态下，采集空腹静脉血4 mL，其中2 mL注入干燥管，分离血清，采用日立全自动生化分析仪测定血脂指标，血清总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平测定采用CHOD-PAP法和GPOPAP法试剂盒（宁波瑞源）。剩余2 mL注入EDTA抗凝管，待提取DNA。

1.3 载脂蛋白E的基因分型 采用QIAamp DNA血液迷你试剂盒（凯杰）从200 μL EDTA抗凝外周血中提取基因组DNA样本。提取的基因组DNA 溶解在洗脱缓冲液（10 mM Tris HCl，0.5 mM EDTA，pH 9.0）中，使用nanodrop分光光度计测量DNA浓度（赛默飞世尔），-20 ℃保存。

等位基因特异性PCR（AS-PCR）：每个样本同时设置两个平行的PCR反应体系，分别对应该SNP位点的两种碱基形式，APOE*4（rs4293581）使用C 反应体系与T 反应体系，APOE*2（rs7421）使用G反应体系与A反应体系。引物序列，见表1。PCR反应体积为20 μL，扩增参数：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性10 s，55 ℃延伸40 s（收集荧光），72 ℃退火40 s，40 个循环。最后根据样本在两反应体系中的FAM 通道扩增表现判断基因型。引物序列，见表1。

表1 APOE基因型检测引物序列Table 1 APOE genotype detection primer sequence

1.4 统计学方法 采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，采用Hardy-Weinberg平衡（H-W）对正常组样本基因分型结果进行检验，计量资料以“±s”表示，组间比较采用独立样本t检验；APOE 基因型和等位基因频率比较采用Person卡方检验，相对危险度采用比值比（OR）和95%CI；血脂水平比较采用单因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 APOE等位基因在世界不同地区健康孕龄妇女中的分布APOE基因多态性与子痫前期相关性已得到最广泛的研究，但不同地域研究的结论并不一致。为了明确APOE等位基因频率在世界各地的分布情况，对已发表文献正常组样本中APOE等位基因的分布进行统计，共纳入10篇文献数据，结果显示，新疆地区健康人群APOEε2、ε3、ε4 等位基因频率分别为8.92%、80.05%和11.03%，ε2、ε3等位基因频率与南非地区差异有统计学意义（P＜0.05），ε4等位基因频率与南非、中国广东、芬兰和伊朗地区差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 APOE等位基因在世界不同地区健康孕龄妇女中的分布Table 2 Distribution of the ApoE allele in healthy women of gestational age from different regions of the world

2.2 正常组和病例组APOE等位基因和基因型分布及H-W平 衡检验 为了验证本次纳入的研究对象是否来自同一个群体，将APOE基因型分布进行H-W平衡检验。结果显示，基因型在正常组（汉族、维吾尔族、回族、哈萨克族及总样本）和病例组（重度子痫前期和轻度子痫前期）的分布均符合H-W 平衡。说明研究样本符合群体基因遗传平衡，数据具有良好的群体代表性，见表3。

表3 正常组和病例组APOE等位基因和基因型分布及H-W平衡检验Table 3 APOE allele and genotype distribution and H-W balance test in normal group and patient group

2.3 3 组孕妇临床特征比较 与正常组相比，重度子痫前期组和轻度子痫前期组甘油三脂和总胆固醇水平更高（P＜0.05），但重度子痫前期组和轻度子痫前期比较差异无统计学意义，见表4。

表4 3组孕妇临床特征比较Table 4 Comparison of general clinical characteristics among three groups

2.4 APOE基因多态性与子痫前期（重度/轻度）发生风险的相关性研究 APOE 基因多态性与子痫前期相关性分析结果，经过卡方检验分析，APOE的等位基因频率分布在重度子痫前期组[ε2vs.ε3：OR=1.29（0.71～2.37），P=0.42；ε4vs.ε3：OR=0.80（0.42～1.54），P=0.51]和轻度子痫前期组[ε2vs.ε3：OR=0.72（0.22～2.42），P=0.80；ε4vs.ε3：OR=0.80（0.28～2.30），P=0.86]与正常组比较差异均无统计学意义，以显性模式进行基因型分布分析，重度子痫前期组[E2/2+E2/3vs. E3/3：OR=1.33（0.67～2.63），P=0.42；E3/4+E4/4vs. E3/3：OR=0.88（0.43～1.81），P=0.72]和轻度子痫前期组[E2/2+E2/3vs. E3/3：OR=0.82（0.23～2.93），P=1.00；E3/4+E4/4vs. E3/3：OR=0.89（0.47～1.69），P=0.72）与正常组比较差异无统计学意义。

2.5 3 种等位基因携带者在正常组和重度/轻度子痫前期组中血脂水平分别比较正常组和子痫前期组中APOE ε2、ε3 和ε4 等位基因携带者的血脂指标差异，发现重度子痫前期组中，ε2 和ε4 等位基因携带者的甘油三酯水平高于ε3，且ε2等位基因携带者的甘油三酯水平与ε3比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。

3 讨论

APOE基因多态性与子痫前期之间的相关性已在国内外进行了广泛的研究，然而，不同地区的结果并不一致。本研究调查世界不同地区健康孕龄妇女中APOE等位基因频率的分布差异，研究结果证明，APOE ε2、ε3和ε4等位基因的分布具有显著的地域差异。新疆地区位于我国西北内陆地区，自然地理环境独特，因此相比于我国其他地区，该地区人群的APOE基因多态性分布及与子痫前期发生的相关性可能有其特殊性。

虽然子痫前期是一种多因素疾病，但具有家族聚集的一般趋势，表明遗传因素可能发挥重要作用。ApoE 是血脂异常和动脉粥样硬化的已知遗传标记，在脂质代谢中具有重要作用。一项META分析报告证明，E2/2+E2/3和E3/4+E4/4基因型的受试者TG 水平高于E3/3 受试者[18]。本研究结果表明，相比于ε3，ε2等位基因携带者的甘油三酯水平显著升高（P＜0.05）。推测APOE 基因多态性与重度子痫前期孕妇脂质变化可能有关。由于APOE基因多态性与脂质谱之间的关系可能受未经调整的环境因素的影响，因此，有必要通过扩大样本量、校正环境因素进行进一步研究。本研究共纳入正常组280例和子痫前期组107例，为了避免纳入样本的异质性造成的偏倚，将病例分为轻度子痫前期组和重度子痫前期组。研究结果表明，APOE 基因多态性与轻度子痫前期和重度子痫前期均无相关性。结合近期一项META分析证明APOE基因与子痫前期的发生的风险间的相关性比较差异无统计学意义[19]，因此，在新疆地区，APOE 基因多态性在子痫前期的发展中似乎无关键作用。事实上，子痫前期并没有一个单一的遗传原因，母体基因型是导致易感性的主要因素，但胎儿的基因型也可能参与其中[20]。家族研究表明，遗传和环境因素共同影响脂质代谢的变异[21]。本研究结论仍需通过更大样本的研究进一步验证。

表5 3种等位基因携带者在正常组和重度/轻度子痫前期组中血脂水平（±s，mmol/L）Table 5 Lipid levels in carriers of the three alleles in the normal and severe/mild preeclampsia groups(±s,mmol/L)

表5 3种等位基因携带者在正常组和重度/轻度子痫前期组中血脂水平（±s，mmol/L）Table 5 Lipid levels in carriers of the three alleles in the normal and severe/mild preeclampsia groups(±s,mmol/L)

组别正常组（n=280）重度子痫前期组（n=81）轻度子痫前期（n=26）生化指标甘油三酯总胆固醇甘油三酯总胆固醇甘油三酯总胆固醇ε32.27±0.133.59±1.364.08±1.386.38±2.053.80±0.836.16±1.81 ε22.28±0.153.24±1.275.15±1.536.37±1.263.44±0.715.50±1.75 ε42.29±0.133.79±1.054.10±0.986.53±1.013.56±0.215.76±2.91 F值0.3531.6043.2150.0310.3170.174 P值0.7030.2030.0460.9690.7320.841