母体孕期维生素D缺乏诱发胎儿生长受限

付 林，陈远华，于 震，王 华，赵 卉，徐德祥

(1.安徽医科大学第二附属医院，呼吸与危重症医学科，安徽 合肥 230041; 2.安徽医科大学公共卫生学院，安徽 合肥 230031)

胎儿宫内生长受限(fetal intrauterine growth restriction，IUGR) 是指胎儿未能达到其遗传决定的全部生长潜能[1]。IUGR不仅与死胎风险的增加有关，同时也是造成围产期胎儿高发病率和死亡率主要原因[2]。维生素D (vitamin D，VD)是一种甾体类固醇激素，近年来母体孕期维生素D缺乏(vitamin D deficiency，VDD)与IUGR的关系受到越来越多的关注，流行病学发现孕期VDD增加了IUGR的发生风险[3]，但是机制不清。因此，本研究旨在通过低维生素D饲料喂养构建VDD诱发IUGR孕鼠模型，并从胎盘糖皮质激素屏障功能方面探讨VDD诱发IUGR的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂本研究所用小鼠均为SPF级CD-1小鼠，购于北京维通利华公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2017-0012。4周龄雌鼠体重(19～21)g，饲养在恒温恒湿环境中，自由饮水和进食，维持恒定昼夜节律。适应性喂养1周以后，随机均匀分成对照组(CTRL组)和维生素D缺乏组(VDD组)。正常饲料和低维生素D饲料购买于南京特洛菲公司。糖皮质激素试剂盒购买于武汉华美生物公司。小鼠11β-HSD2引物由上海生工技术有限公司合成。一抗购于美国Abcam公司。

1.2 动物模型的制备实验动物随机分为2组：对照组(CTRL组)、维生素D缺乏组(VDD组)，每组雌鼠40只。CTRL组小鼠喂养标准饲料(VD含量>800 IU·kg-1)，VDD组小鼠饲养在无紫外光照的房间中，并喂以低维生素D饲料(VD含量<25 IU·kg-1)。饲养5周以后，每组随机取6只雌鼠，异氟烷麻醉小鼠，摘眼球取血、脱臼处死小鼠，检测血清中25-(OH)-D水平。剩余36只雌鼠与正常雄鼠交配，在妊娠d 16剖杀6只孕鼠，留取胎盘；在妊娠d 19剖杀剩余孕鼠，观察妊娠结局。

1.3 蛋白免疫印迹取胎盘匀浆，吸取上清液并离心，吸取上清液250 μL，煮沸变性，所得即为胎盘总蛋白。接下来进行SDS-PAGE电泳，组装灌胶卡槽，灌入合适高度的分离胶和浓缩胶。然后使用微量进样器加入等量的蛋白样品，开始电泳。电泳结束后剪下所需分子量的凝胶，进行转膜，孵育一抗和二抗，发光显影、拍照并分析灰度值。

1.4 酶联免疫吸附实验所有试剂盒于室温中复温30 min，建立标准曲线。在酶标板中加入标准品和待测血清，孵育一抗和二抗，加入显色液继续反应，最后用酶标仪检测吸光度值[4]。

1.5 逆转录-聚合酶链反应取胎盘加入TRIzol匀浆，用氯仿萃取RNA，加入异丙醇，轻轻颠倒摇晃EP管。然后4 ℃ 15 000×g离心10 min，留下沉淀，干燥RNA。加入适量无酶水，溶解RNA并定量至500 μg·L-1。取2 μg RNA进行逆转录，反应结束进行后续的PCR实验[5]。

2 结果

2.1 孕期维生素D缺乏诱发IUGR维生素D缺乏 (VDD)饲料喂养小鼠，5周后检测血清25-(OH)-D水平。结果Tab 1所示，VDD组小鼠血清中25-(OH)-D水平低于CTRL组(5 μg·L-1vs23 μg·L-1)。在孕d 19剖杀孕鼠，发现两组孕鼠在活胎、死胎以及吸收胎上无差异。称量胎鼠重和胎盘重，结果发现VDD组胎鼠重和胎盘重低于CTRL组。此外，VDD组胎鼠身长和胎盘直径均低于CTRL组,见Tab 1。

Tab 1 The pregnancy outcome of mice in two

2.2 孕期维生素D缺乏损伤胎盘糖皮质激素屏障功能我们检测了胎盘11β-HSD2的表达水平，结果发现VDD组胎盘11β-HSD2蛋白和mRNA水平低于CTRL组；此外，胎血中糖皮质激素水平也被检测，我们发现VDD组胎鼠中GC水平高于CTRL组[(315.6±18.32) ng·L-1vs(506.3±23.46) ng·L-1]。

3 讨论

本研究通过低维生素D饲料喂养成功构建VDD小鼠模型，发现VDD组和CTRL组在活胎、死胎以及吸收胎数上无差异；孕期VDD减轻了胎鼠和胎盘重，降低了胎鼠身长和胎盘直径。以上结果表明，母体孕期VDD可诱发IUGR，但机制不明。Ⅱ型11β-羟基固醇脱氢酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase 2, 11β-HSD2)是一类重要的糖皮质激素代谢酶。研究发现[6-7]，胎盘11β-HSD2能够代谢有生物学活性的皮质醇为无生物学活性的皮质酮，预防母体内过多的GC透过胎盘进入胎儿体内，维持正常发育。本研究发现11β-HSD2表达在VDD组胎盘上降低，GC水平升高。以上结果提示，母体孕期VDD可能通过下调胎盘11β-HSD2表达，导致母体内过多GC进入到胎儿体内进而诱发IUGR。