NLRP3炎性小体与糖尿病心肌病的发生发展

黄芷棋，宁一博，贺润铖，孙建宁，董世芬

(北京中医药大学中药学院中药药理系，北京 102488)

糖尿病心血管并发症是糖尿病的首要致死原因，病变部位包括大血管和微血管，由微血管弥漫性损伤造成的糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是当前的热点研究之一。糖尿病性心肌病是1972年由Rubler等[1]首次提出。作为糖尿病特异心脏并发症，DCM可独立于冠状动脉疾病、高血压或瓣膜性心脏病发生心肌功能障碍，并与糖尿病患者的心力衰竭高发生率和高死亡率密切相关。

DCM早期临床症状不明显，与其它糖尿病并发症相比研究相对滞后，确切的发病规律至今尚未完全阐明，也尚无公认的诊疗方法。疾病早期，高胰岛素血症、胰岛素抵抗、游离脂肪酸和外周血循环瘦素水平增高以及肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)激活即可诱导左心室肥厚发生[2]，表现为心肌细胞结构改变、左心室容积、室壁厚度和紧张性、左心室重量等增加；随着甘油三酯堆积和Ca2+转运缺陷，成纤维细胞增殖以替代死亡的心肌细胞，并由转化生长因子-β1(transforming growth factor beta1，TGF-β1)介导心肌细胞的纤维化[3]，导致左心室舒张功能下降，并逐渐转变为以扩张型心脏重塑为特点的收缩功能障碍，进一步可能发展成为缺血性心脏病和心衰[4]。

目前公认的发病机制包括高血糖、蛋白非酶糖基化、氧化应激、心肌纤维化、钙离子转运异常、脂肪酸氧化增加以及神经内分泌功能激活等[5]。有研究指出，炎症是糖尿病患者左室舒张功能障碍的独立相关因素[6]。近年发现NLRP3炎性小体在机体炎症反应中起着重要作用，NLRP3炎性小体可通过促进DCM心脏炎症，从而影响心脏功能。本文综述NLRP3炎性小体在DCM发生发展过程中的作用，以为深入阐释该疾病的病理进程以及相关药物的开发提供借鉴。

1 NLRP3炎性小体及其激活机制

炎性小体是由模式识别受体(pattern recognition receptor，PRRs)形成的多蛋白复合物，是先天免疫应答的重要组成部分。模式识别受体包括Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR)、黑色素瘤缺乏因子2受体(absent in melanoma 2，AIM2)等[7]。大多数NLR包含3个结构域，即C端富亮氨酸重复区域(leucine-rich repeats，LRR)、中央核苷酸结合和寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain，NACHT)、N端热蛋白结构域(pyrin domain，PYD)。

核苷酸结合寡核苷酸结合域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)是最常见的炎性小体。典型的NLRP3炎性小体复合物是一种胞内蛋白复合物，由“感应蛋白”NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)和“效应器”pro-caspase-1组成[7]。NLRP3炎性小体广泛分布于免疫细胞，如巨噬细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞等，还可分布于非免疫细胞，如成纤维细胞和心肌细胞等，许多疾病发生时(高血压、糖尿病、糖尿病心肌病、动脉粥样硬化、抑郁症、阿尔茨海默病、哮喘等)，可发现NLRP3表达上调。

NLRP3炎性小体的活化由启动和组装两个独立且平行的步骤实现。第一步启动阶段，Toll样受体识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)后，诱导NF-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)转录，上调NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18的表达；第二步组装阶段，继续由各种PAMPs、DAMPs或病原微生物刺激介导，并促进NLRP3、ASC和pro-caspase-1寡聚进而激活NLRP3炎性小体，随后产生有活性的caspase-1。caspase-1的激活将无活性的促炎细胞因子pro-IL-1β、pro-IL-18切割为其对应成熟的分泌因子IL-1β和IL-18，并介导细胞焦亡(pyroptosis)[7]。细胞焦亡是一种细胞程序性死亡，其表现与细胞凋亡、细胞坏死的特征部分重叠，如DNA损伤、TUNEL染色阳性、Annexin V染色阳性、细胞膜上孔隙形成、细胞裂解等[8]。因此，NLRP3、caspase-1、IL-1β表达增加以及细胞焦亡是NLRP3炎性小体异常激活并介导炎症的主要表现。

目前的相关研究[9]通常把NLRP3炎性小体的激活概括成三条不同的信号通路：① 细胞外ATP诱导K+通过嘌呤能受体(purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor，P2X7)外排，从而导致NLRP3炎性小体的组装和激活；② PAMPs和DAMPs触发活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成，促进NLRP3炎性小体的组装和激活；③ 细胞内形成的结晶或颗粒结构导致溶酶体破裂以及溶酶体内容物如组织蛋白酶B的释放，从而诱导NLRP3炎性小体的组装和激活。此外，NLRP3炎性小体的组装和激活还涉及到其他触发因素，包括内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)、自噬功能障碍和Ca2+超载等。

Fig 1 The signaling pathway of NLRP3 inflammasome activation

2 NLRP3炎性小体与糖尿病心肌病

NLRP3炎性小体已被证实与糖尿病心肌病中无菌性炎症反应有关，抑制NLRP3炎性小体可有效减轻DCM炎症反应，从而改善DCM 胰岛β细胞功能受损、心肌损伤以及心肌纤维化等过程。

2.1 NLRP3炎性小体参与DCM胰岛β细胞功能受损胰岛β细胞数量减少或功能受损导致高血糖是糖尿病的重要发病机制之一。糖尿病的长期高血糖状态可引起持续性炎症、氧化应激和心脏收缩功能障碍，是DCM的始发因素。

研究表明，NLRP3炎性小体可通过分泌IL-1β参与2型糖尿病心肌病的胰岛损伤过程。Schroder等[10]发现在2型糖尿病发病过程中，胰岛持续的高血糖状态引发糖酵解增加并过度刺激线粒体电子传递链导致ROS的生成，ROS作为激动剂激活NLRP3炎性小体并分泌成熟的促炎细胞因子IL-1β。IL-1β升高会引起β细胞死亡和功能障碍，导致葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少，加速糖尿病的进程。使用IL-1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Ra)可改善胰岛素分泌和降低血糖，提高胰岛β细胞存活率，从而改善胰岛功能。通过敲除慢性肥胖小鼠的NLRP3基因，可保护胰岛β细胞免受细胞死亡，从而减缓肥胖向糖尿病及其并发症的发展[11]。孔祥等[12]发现糖化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)可通过ROS途径激活巨噬细胞中的NLRP3炎性小体并分泌IL-1β损伤胰岛β细胞，沉默NLRP3基因可改善该过程。

硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interactingprotein，TXNIP)是调节胰岛β细胞生理病理学功能的关键蛋白。相比其他类型细胞，TXNIP主要在分泌胰岛素的β细胞中高度表达。内质网应激通过PERK和IRE1通路上调TXNIP的表达，TXNIP作为促发因子激活NLRP3炎性小体并增加IL-1β分泌，导致β细胞损伤[13]。另外，该过程分泌的IL-1β能够与胰岛β细胞表面的IL-1受体(interleukin-1 receptor，IL-1R)结合，从而诱导其自身表达，形成更多的IL-1β，加速糖尿病病情的发展[14]。在糖尿病心肌病模型中，高血糖诱导的ROS生成增多可促使硫氧还蛋白和TXNIP的复合物解离，随后TXNIP以依赖氧化还原的方式激活NLRP3炎性小体进而产生一系列的生理活动影响胰岛的结构和功能[15]。

2.2 NLRP3炎性小体参与DCM心肌损伤过程心肌细胞坏死、凋亡和肥大是造成DCM患者心脏结构和功能损伤，甚至发展成为心衰的重要原因。糖尿病高糖、高脂环境下心肌细胞ROS增多，可促进NLRP3炎性小体激活。李雪莲等[16]研究发现，糖尿病大鼠心肌组织中活性氧水平升高，心肌凋亡细胞明显增加以及心肌间质呈现明显的胶原纤维堆积，同时心肌组织中NLRP3和IL-1β基因阳性表达上调。采用药物抑制NLRP3炎性小体激活可明显减轻炎症和改善心脏功能。Luo等[17]发现用高糖刺激的H9c2心肌细胞，其caspase-1表达升高，并出现细胞焦亡。沉默NLRP3基因后糖尿病大鼠心肌细胞焦亡和心肌纤维化显著减少，心脏功能改善。提示NLRP3-caspase-1依赖的细胞焦亡是DCM发生时心肌细胞死亡的一个重要因素。

心肌细胞凋亡与心肌细胞肥大两种损伤形式可相互作用，进而影响心脏功能。NLRP3炎性小体不仅通过IL-1β促进结构性心肌病，也可通过IL-1β加重左心室肥厚。Lim[18]研究表明，AGEs可以通过激活NF-κB-NLRP3-IL-1β信号通路诱导心肌肥大。NLRP3敲除可抑制血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)刺激引起的心肌细胞肥大。

2.3 NLRP3炎性小体参与DCM心肌纤维化过程心脏纤维化的特征是由纤维状胶原组成的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在心肌间质中过多沉积。心脏纤维化会导致疤痕组织积累，左心室僵硬度增加，可引发心脏功能障碍。研究发现糖尿病大鼠心脏成纤维细胞内NLRP3炎性小体活化水平升高。Zhang等[19]表明在DCM的高糖环境下，ROS和P2X7R可以介导NLRP3炎性小体激活，促进新生大鼠心脏成纤维细胞胶原合成，导致心肌纤维化。相反，H3松弛素(H3 Relaxin)能够在高糖环境下明显减弱P2X7受体介导的NLRP3炎性小体激活，从而抑制心脏成纤维细胞胶原合成[20]。也有研究表明，NLRP3炎性小体的激活会抑制了心肌成纤维细胞中cAMP的释放并抑制心肌收缩[21]。体外研究表明，IL-1β、IL-18均可通过剂量依赖性的方式刺激胶原蛋白的表达，具有促心肌纤维化作用[22]。

Bracey等[23]发现，在TGF-β1的刺激下，心脏成纤维细胞中NLRP3炎性小体的表达增加。另外，NLRP3在心脏成纤维细胞中可以不依赖于细胞因子释放的新机制促进纤维化信号转导，这主要表现在NLRP3通过NACHT结构域促进R-Smad活化和心肌成纤维细胞分化。活化的R-Smad与Co-Smad 结合形成转录复合物从而促进促纤维化基因的表达。在体内，NLRP3缺失的心脏成纤维细胞对TGF-β的反应表现为肌成纤维细胞分化受损和R-Smad活化减少。提示NLRP3可直接促纤维化作用。

3 中药对糖尿病心肌病NLRP3炎性小体的干预作用

目前中药对糖尿病心肌病NLRP3炎性小体的干预研究起步较早，且多局限于动物实验方面。云芝是一种传统药用真菌，其提取物具有抗肿瘤，免疫调节等作用。现研究表明，云芝提取物可以通过抑制NF-κB通路减弱NLRP3炎性小体激活，使得DM大鼠caspase-1、IL-1β、IL-18和NLRP3炎性小体水平降低，从而减轻心脏炎症和改善心功能。此外，云芝提取物还可以通过抑制TGF-β1/ Smad信号传导，减轻DM大鼠的心脏纤维化[24]。

绞股蓝为葫芦科植物绞股蓝Gynostemmapentaphylla(Thunb.)Makino的全草，又名七叶胆、落地生、遍地生根。绞股蓝皂苷(Gypenoside，GPS)是绞股蓝的主要活性成分之一，具有抗炎、降血糖、保护心脏等作用。在H9C2细胞及DCM的小鼠模型中均发现高糖诱导NLRP3炎性小体活化可引起心肌细胞凋亡。高糖通过剂量依赖性促进ROS产生从而活化NLRP3炎性小体。绞股蓝皂苷通过降低线粒体ROS的水平，即调节NLRP3炎性小体的启动步骤，抑制NLRP3炎性小体的激活以及IL-1β和IL-18的分泌，进而改善糖尿病心肌病的心肌损伤[25]。

槲皮素是一种天然黄酮类化合物，广泛存在于槐花、桑叶、银杏叶、旋覆花、车前子等中药。糖尿病大鼠模型经槲皮素治疗后，可明显抑制炎性小体蛋白表达量，改善心肌间质纤维化病变及心肌凋亡。这表明，槲皮素可通过介导NLRP3炎性小体减轻糖尿病大鼠中高糖诱导的心功能受损[16]。

柚皮素(naringenin)属于二氢黄酮类化合物，是枳壳、枳实、骨碎补、化橘红等中药的主要有效成分之一。柚皮素可通过下调心脏组织的NLRP3炎性小体蛋白(NLRP3、caspase-1和ASC)、IL-1β及I型胶原蛋白、FN纤粘连蛋白，进而减少心肌细胞凋亡、改善心肌纤维化，抑制心肌重构[26]。

中药成分熊果酸(ursolic acid，UA)广泛存在于植物界中，如山楂、夏枯草、白花蛇舌草、栀子、车前草等。通过高脂喂养联合链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立小鼠2型糖尿病模型发现，模型组小鼠出现心肌纤维排列紊乱、心肌组织炎性细胞浸润、心肌细胞肥大、坏死的情况。熊果酸干预8周后，糖尿病小鼠心肌病变明显改善，其机制与抑制NLRP3炎性小体活化，减少IL-1β表达有关[27]。

无患子皂苷(Soapnut Saponin)是野生落叶乔木无患子(SapindusmukorossiGareth.)果皮的提取物，含有丰富的糖苷类物质，主要为三萜皂苷类、倍半萜糖苷类。用高糖诱导H9C2细胞损伤和焦亡，caspase-1、IL-1β两种蛋白表达水平较正常组升高，免疫组化染色和Western blot结果均显示无患子皂苷处理可抑制caspase-1及IL-1β水平。综上所述，无患子皂苷可通过NLRP3调控caspase-1、IL-1β等下游基因抑制H9C2心肌细胞损伤[28]。

4 结语和展望

综上，NLRP3炎性小体参与糖尿病心肌病的发生发展过程。NLRP3炎性小体活化可诱发或加剧DCM患者心脏心肌炎症、心肌细胞坏死或凋亡、心肌纤维化及其他心脏功能障碍。目前以NLRP3为靶点，研究药物干预糖尿病心肌病作用处于起步阶段，已有研究证实中药的干预作用可影响NLRP3炎性小体的启动和活化，也可影响其下游基因的表达，进而抑制DCM的心肌损伤，改善心脏功能，但是具体机制尚需深入研究。糖尿病心肌病发生时，心肌脂质代谢紊乱，脂质小分子代谢物组谱失衡，而脂质代谢产物如神经酰胺可以充当NLRP3炎性小体的激活信号，影响糖尿病等代谢性疾病的发展。研究小檗碱等可通过调控脂质组学改善DCM心肌损伤[29]，并对NLRP3炎性小体有调控作用[30]，值得深入探讨。