高灵敏荧光定量检测HCV-RNA在丙肝诊疗中的应用研究

吴嘉锐 王军 梁连辉 邓纪望 李淑丽 何娟 蔡常辉

广东省中山市第二人民医院检验中心，广东中山 528447

丙型病毒性肝炎（hepatitis C virus，HCV 简称“丙肝”）是较常见的一种肝脏疾病传染性疾病，呈全球流行，不同性别、年龄、种族人群均对HCV 易感，HCV 的感染具有隐匿性，丙型肝炎病毒也是导致肝硬化和肝细胞癌的主要危险因素[1-2]。HCV 无或仅有轻微的临床症状和体征，缺乏特异性，临床诊断十分困难，必须依赖实验室诊断。而实验室诊断中病原学的诊断是确定诊断的唯一依据。HCV基因组为单股正链 RNA，易变异，HCV 感染的实验室诊断包括抗原、抗体检测和HCV-RNA 定量检测，其中抗原的检测主要用于免疫缺陷等特殊患者的筛查，抗-HCV 检测主要用于一般HCV 感染者的初筛，血清 HCV-RNA 定量检测是实验室诊断丙型肝炎的金标准，且不同厂家试剂提取核酸方法不同，灵敏度和和特异性不同，直接影响临床诊疗方案的制定[3-5]。中国HCV 防治现状可以概括为“三高三低”，就是说“高隐匿、高漏诊、高慢性化，认知率低、就诊率低、治疗率低”。早诊断、早发现、早治疗是防控HCV 传染源和阻断传播途径最为有效的手段[6-7]。新出现的“磁珠法”提取核酸，提取效率高，操作步骤简单，重复性好，可溯源，可实现自动化，是未来核酸分离纯化方法发展的一个重要方向。本研究通过高灵敏荧光定量检测丙型病毒性肝炎病毒核酸（HCV-RNA）在丙型病毒性肝炎诊疗中效果，取得满意的临床疗效，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年2月至2019年2月中山市第二人民医院（我院）肝病门诊及戒毒所体检可疑感染丙肝的患者临床血清样本126例，其中年龄19～62 岁，平均（33.84±6.59）岁，纳入标准：①均符合《丙型肝炎防治指南》的慢性丙型肝炎诊断标准[8]；②依从性良好，自愿配合本研究者；③所有丙型病毒性肝炎患者均经本院医学伦理委员会研究决定，知情并自愿签署同意书。排除标准：①合并乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒等嗜肝病毒感染的患者；②具有发生肝硬化或者原发性肝癌的患者；③具有肝硬化、原发性肝癌及自身免疫性肝病的患者；④合并其他免疫系统疾病、精神疾病及孕妇或妊娠期妇女；⑤依从性差不能配合本研究的患者。将所有体检可疑感染HCV 的患者临床血清样本126例，分别采用HCV 磁珠法试剂和对照试剂检测血清中RNA 水平。

1.2 方法

1.2.1 血液标本收集 收集肝病门诊及戒毒所体检可疑感染丙肝的血液标本，所有患者于入组后清晨空腹抽取外周静脉血3 ml 及5 ml，每位患者共2 支标本，一支为EDTA(紫色管)3 ml，一支为红色无抗凝管5 ml；3000 r/min 离心10 min 取上清，-20℃储存。

1.2.2 研究方法 ①分别用磁珠法提取核酸荧光定量PCR 试剂及柱提取核酸荧光定量PCR 试剂测定病毒核酸HCV-RNA 载量；②用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法检测丙肝核心抗原、抗体。

1.3 观察指标

观察分析采用磁珠法试剂和对照试剂检测血清中RNA 水平。

1.4 统计学处理

本研究数据采用SPSS 23.0 统计学软件计算分析，计量资料以()表示，采取Kappa检验分析，血清中RNA 水平比较采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 磁珠法试剂和对照试剂检测血清中RNA水平的比较

磁珠法试剂检测126例样本中有54例阳性，72例阴性；对照试剂检测126例临床样本中有44例阳性，82例阴性，磁珠法试剂和对照试剂检测血清中RNA 水平阳性率比较，差异无统计学意义（χ2=1.670，P=0.196），见表1.

表1 HCV磁珠法试剂和对照试剂定量检测血清中RNA水平的比较[n(%)]

2.2 磁珠法试剂和对照试剂HCV荧光定量检测结果比较

126例临床样本的 HCV 荧光定量检测试剂的检测结果，见表 2。

表2 磁珠法试剂和对照试剂HCV荧光定量检测结果

2.3 磁珠法试剂和对照试剂高灵敏荧光定量检测结果一致性分析

磁珠法试剂和对照试剂检测结果阳性一致性为100.00%，阴性一致性为87.80%（72/82），总一致性为92.06% [（44+72）/126]。对磁珠法试剂和对照试剂检测结果的一致性采取Kappa分析，磁珠法试剂和对照试剂检测结果的存在显著一致性(Kappa=0.162，P=0.0000)，见表3。

表3 磁珠法试剂和对照试剂高灵敏荧光定量检测结果一致性分析

2.4 磁珠法试剂和对照试剂相关性分析

对磁珠法试剂和对照试剂检测结果都为阳性的 44例样本，分别取对数值。分析结果显示，磁珠法试剂与对照试剂的定量检测结果具有线性相关（r=0.947，P=0.003），磁珠法试剂与对照试剂的回归方程y=0.634x+0.9000。

3 讨论

目前全世界约有1.85 亿人感染丙型肝炎病毒，HCV 是由丙型肝炎病毒引起的，感染率逐年增高，呈全球性流行，常规传播途径主要是母婴传播、医疗机械传播、经破损的皮肤和黏膜传播，全世界不同性别、年龄、种族人群均对 HCV 易感，且每年新增感染者约35 万，以肝脏病变为主的传染性疾病，表现为急性和慢性病毒性肝炎（50%～85% 的丙型肝炎），其中慢性丙肝可发展成纤维化、肝硬化（10%～15% 的患者）甚至肝细胞癌，这就势必增加了肝癌的发生率，死亡人数也成倍增长[9-10]。丙肝起病隐匿，大部分患者症状不明显，最新文献显示，75%～90%HCV 感染者未意识到自身的感染情况，80%HCV 感染者发展为慢性肝炎。丙肝已经被公认为是造成全球慢性肝脏疾病的主要原因，约有27%肝硬化、25%肝癌是由丙肝引起的[11-12]。对丙肝进行早期准确诊断、进行科学合理治疗和疗效监测具有重要的临床价值。常规的诊断方法包括HCV-RNA、HCV 重组免疫法，丙肝已经成为不可忽视的公共卫生问题，应当进一步深入研究。

HCV 感染的实验室诊断包括抗原、抗体、和HCV-RNA 定量检测，其中抗-HCV 检测主要用于HCV 感染者的的初筛，抗原的检测主要用于免疫缺陷等特殊患者的筛查，高敏感度 HCV-RNA 定量检测已经成为丙肝治疗监测的趋势，而HCV-RNA 定量检测是唯一确定HCV 现症感染的实验室指标，作为典型的,HCV-RNA 病毒分裂，通常在检定过程中，被视作金标准[13]。对于抗原或抗-HCV 阳性者，应进一步进行HCV-RNA 定量检测，以确定是否为丙型肝炎患者。根据丙型肝炎防治指南（2015年更新版）意见，HCV-RNA 定量检测是诊疗丙肝的“金标准”，抗病毒治疗前病毒基线载量分析，抗病毒治疗过程中及治疗结束后的应答评估，均需要高灵敏准确丙肝核酸检测。由此可见，选择一种高灵敏的丙肝核酸检测方法至关重要。

目前国内外丙肝核酸的检测方法有多种，质量也参差不齐，实验灵敏度相差甚远。在各种方法中，血清或血浆样本中病毒核酸的提取手段，是影响HCV-RNA 定量结果最为关键的因素之一。新出现的“磁珠法”提取核酸，提取效率高，操作步骤简单，重复性好，可溯源，可实现自动化，是未来核酸分离纯化方法发展的一个重要方向。磁珠法核酸提取是以磁珠为载体，通过运用磁珠在高盐低pH 值下吸附核酸，在低盐高pH 值下与核酸分离的物理方法的原理过程，并采取移动磁珠或转移液体来实现核酸的整个提取纯化过程[14-15]。磁珠法（MBM）提取核酸建立了一种快速、简便的血清或血浆病毒核酸提取方法。我院检验中心使用MBM 来纯化核酸的最大优点就是自动化，省时省力，有效的降低了人工成本，提取方法简便、快捷。磁珠在磁场条件下能够显著地进行聚集或分散,彻底摆脱离心等所需的手工操作流程，可以尽快的得到试验数据，有效地减少了试验成本，大大地降低了患者的经济负担且，且早日为患者的确诊及治疗争取了时间。

本研究结果显示，磁珠法试剂检测126例样本中有54例阳性，72例阴性；对照试剂检测126例临床样本中有44例阳性，82例阴性，磁珠法试剂和对照试剂的阳性样本具较好的一致性（P=0.000），磁珠法试剂与对照试剂的定量检测结果具有线性相关（r=0.947，P＜0.05）。本研究中采用磁珠法提取核酸高灵敏荧光定量检测HCV-RNA 在中山市乃首创，如能在中山市医疗系统重点单位顺利推广或为本区域患者集中检测，将为广大丙肝患者的抗病毒治疗带来新的认识，进一步取得新的疗效。