正交试验法优选复方天麻控释胶囊的提取工艺研究

杨瑞虹 任建萍 智翠梅

1.山西卫生健康职业学院药学院，山西太原 030012；2.太原科技大学化学与生物工程学院，山西太原 030021

复方天麻控释胶囊由天麻、钩藤、白芍和栀子等12 味中药组成，为天麻钩藤饮的改进处方，中医临床使用结果表明本方具有清热安神、平肝熄风等功效，适用于肝阳上亢、肝风内扰型头痛、失眠及眩晕等症[1-3]。将该处方采用适宜的方法提取，并采用现代控缓释技术，制成控释胶囊，达到延长药效的作用，有利于长期头痛、失眠患者服用[4]。处方中君药为天麻，主要生物活性成分是天麻素（gastrodin），其结构（对羟甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷）中含有多个羟基和苷键，极性较大，易溶于水、乙醇、甲醇等极性溶媒，据文献报道[5-11]，天麻既可用水提取，也可采用一定浓度的乙醇提取，但乙醇提取效果较好，可保证有效成分的稳定性。处方中其他有效成分钩藤碱、芍药苷及栀子苷的溶解性与天麻素相似，均可溶解于乙醇，故天麻与其他药材可采用适宜浓度乙醇进行提取。本试验以天麻素含量和提取物出膏率的综合评分为指标，采用高效液相色谱法测定天麻素含量，参照2015年版《中华人民共和国药典》方法[12]测定提取物出膏率，采用正交试验法对复方天麻控释胶囊的提取工艺进行研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；KQ-200VDB 型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；Fw177 型中药材粉碎机（杭州艾普仪器设备有限公司）。

1.2 药材与试药

天麻、钩藤、白芍、栀子等药材均购自山西和仁堂中药饮片有限公司，天麻素对照品购自中国食品药品检定研究院，批号：110807- 201708；无水甲醇（南京化学试剂股份有限公司，色谱级）；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 天麻素含量测定方法[13-15]

2.1.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX-SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（10 ∶90）；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；流速：1.0 ml/min；进样量：10 μl；按天麻素峰计算理论板数不低于2000。

2.1.2 对照品溶液配制 精密称取天麻素对照品（80 ℃真空干燥至恒重）5.25 mg，加无水甲醇溶解定容至5 ml，制成天麻素含量为1.05 mg/ml 的对照品储备液。精密吸取该储备液0.5 ml，加甲醇-水（10 ∶90）稀释定容至10 ml，制得天麻素含量为52.5 μg/ml 的对照品溶液，备用。

2.1.3 供试品溶液配制 精密称取提取物0.1 g，置于100 ml 锥形瓶中，精密量取加入50 ml 甲醇，称重并超声提取60 min，冷却至室温，称定重量，减失的重量用甲醇补足，摇匀后滤过，弃去初滤液，精密量取15 ml 续滤液，水浴蒸干，用甲醇-水（10 ∶90）溶解并定容至10 ml，摇匀后滤过，弃去初滤液，取续滤液经0.45 μm 微孔滤膜过滤，备用。

2.1.4 阴性样品试验 按处方取天麻以外的其他药材，依照该制剂的提取工艺提取，按2.1.3 项下方法配制阴性对照样品溶液，并按2.1.1 项下色谱条件进行测定，液相色谱图显示，阴性样品不干扰天麻素的测定。

2.1.5 线性关系 分别精密吸取2、4、6、8、10、12 μl 天麻素对照品溶液，按2.1.1 项下色谱条件测定，绘制标准曲线（图1），横坐标为天麻素进样量（μg），纵坐标为吸收峰面积，得回归方程Y=156 120X+5524.5，r=0.9998（n=6），表明天麻素进样量在0.105～0.630 μg 范围内具有良好的线性关系。

图1 标准曲线图

2.1.6 精密度试验 精密吸取10 μl 天麻素对照品溶液，连续进样6 次，色谱峰面积分别是1586662、1581203、1582306、1587701、1584065、1581509，RSD 为0.18%，表明该法精密度良好。

2.1.7 重现性试验 取本品提取物6 份，每份约0.1 g，精密称定，按2.1.3 项下方法配制样品供试液，按2.1.1 项下色谱条件测定，色谱峰面积分别是1004661、1002935、998608、999659、999533、1006339，RSD 为0.32%，表明该法重现性良好。

2.1.8 稳定性试验 精密称取本品提取物0.1038 g，按2.1.3 项下方法配制样品供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进行测定，每隔2 h 进样一次，共8 次，色谱峰面积依次为999239、998745、1002368、998785、1001792、1000475、995426、996813，RSD 为0.24%，表明样品溶液在14 h 内稳定。

2.1.9 加样回收试验 取本品提取物5 份，每份约0.1 g，精密称定，置100 ml 锥形瓶中，分别精密加入天麻素对照品，按2.1.3 项下方法配制供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件测定，计算回收率，结果（表1）表明该法的加样回收率良好。

表1 天麻素加样回收率测定结果（n=5）

2.1.10 样品测定 取本品提取物约0.3 g，精密称定，按2.1.3 项下方法配制供试品溶液，分别精密吸取天麻素对照品溶液和供试品溶液各10 μl，按2.1.1 项下色谱条件测定，液相色谱图（图2），按外标法计算天麻素含量。

图2 高效液相色谱图

2.2 单因素试验结果

采用单因素法考察提取溶媒、温度、时间及药材粉碎度和浸泡时间等因素对提取效率的影响。分别用水和一定浓度乙醇（40%、50%、60%、70%）进行提取，结果表明以60%～70%乙醇提取，天麻素含量较高；用60%乙醇采用室温浸渍、热浸渍、回流等方法进行提取，结果显示回流提取天麻素提取率最高；提取时间越长出膏率越高，但天麻素含量却会降低，说明天麻素对热不稳定，同时提取时间延长会使无效成分增多，影响提取物质量，故选择提取时间在1～2 h；药材粉碎度会影响提取效果，粉碎得越细，药材与溶媒接触面积越大，提取率越高，但粉末细度小的提取液不易滤过，因此药材粉碎不宜太细，选择通过20 目筛的药粉为宜；药材回流前浸泡有助于有效成分的浸出和提取，分别考察了浸泡30、60、90、120 min 对提取效果的影响，结果表明浸泡60 min 提取物中天麻素含量较高，但再延长浸泡时间，提取效果无明显改变，故选择浸泡时间为60 min。

2.3 正交试验结果

正交试验在预试验的基础上，选择的影响因素包括乙醇浓度（A）、提取次数（B）、提取时间（C）、溶媒用量（D），根据所制定的因素水平（表2），每个因素包括三个水平，按L9（34）正交表安排试验。

称取处方中药材60 g，粉碎过20 目筛，按表2实验条件加提取溶媒浸泡60 min，进行提取，提取液过滤，滤液加提取溶媒定容于1000 ml 容量瓶，精密量取30 ml，用于测定出膏率；剩余的滤液真空浓缩至稠膏，真空干燥得样品干膏粉，按2.1.10 测定方法测定天麻素含量（以每克药材中提取的天麻素量计），见表3。

表2 正交试验因素水平表

极差分析（表3）中R1表示以出膏率为指标的极差，R2表示以天麻素含量为指标的极差，R3表示以综合评价为指标的极差。结果显示，以出膏率为指标，提取次数影响最大；以天麻素含量为指标，乙醇浓度影响较大，但与其他因素的影响无显著性差异；用综合加权评分法将两种指标转化为分值，综合评分值=（N/Nmax）×60+（W/Wmax）×40，其中“N”表示天麻素含量测定值，“Nmax”表示天麻素含量最大值，“W”表示提取物出膏率测定值，“Wmax”表示出膏率最大值，对综合评分值进行极差和方差分析（表4），结果显示，提取次数影响最显著（P＜0.05），其次为提取时间和乙醇浓度（0.05 ＜P＜0.1），溶媒用量影响最小，最优方案应为A1B3C3D3，即应选择60%乙醇，提取3 次，每次2 h，每次用10 倍的提取溶媒；但由于提取时间和溶媒用量均未显示显著差异性，为降低原料和能源成本，故将提取时间和溶媒用量进行调整，第1 次提取时间1.5 h，溶媒用量为10 倍；第2、3 次提取时间为1 h，溶媒用量为8 倍。

表3 正交试验结果

表4 方差分析表

2.4 最佳提取工艺的验证

称取处方中各药材，粉碎过20 目筛，每次提取前浸泡60 min，按选定的最佳提取工艺条件进行验证，见表5，平均出膏率为19.25%（n=3），天麻素含量平均值为0.9036 mg/g（n=3），证明所选提取工艺条件稳定可行。

表5 验证试验结果（n=3）

3 讨论

中药复方制剂是以中医药理论为依据，其所含的多种生物活性成分，对机体发挥综合的调节作用，提取工艺研究是制剂成型的关键，提取工艺选择应有效提取主要生物活性成分，同时兼顾其他中药的活性成分。预实验对水和不同浓度的乙醇提取工艺进行了比较，结果表明用60%～70%乙醇提取，天麻素提取率较高，且天麻素和钩藤碱对热均不稳定，用适宜浓度乙醇提取可保证各种活性成分的稳定性；在正交试验中，以天麻素含量和出膏率为测定指标，且对两种测定指标引入加权系数进行综合评价，考察了各因素对提取效果的影响，并在考虑降低原料和能源成本的基础上优选最佳提取工艺，即用60%乙醇回流提取3 次，第1 次用10 倍量溶媒，提取1.5 h，第2、3 次分别用8 倍量溶媒，提取1 h，经验证该工艺稳定可行。在用60%乙醇提取过程中由于乙醇易挥发，回流时温度过高、蒸汽量过大、冷凝水流量过小均会导致乙醇挥发，因此需严格控制回流温度，减少加热蒸汽流量，使容器中提取液保持微沸状态，加大冷凝水流量使乙醇在冷凝管中充分冷凝；回流结束后提取液需置于密闭性容器中自然降温，减少乙醇挥发所造成的损失。

天麻素含量测定考察了不同比例甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等流动相对分离效果的影响，选用甲醇-0.1%磷酸溶液（10 ∶90）为流动相，分离效果较好，方法简便易操作、准确且重复性及稳定性良好，可为该制剂研制过程中成品及中间体提供有效的质量控制方法。