消红霜临床前皮肤安全性评价

赵 倩，杨春艳，杨文信

面部毛细血管扩张症（facial telangiectasia，FT）俗称“红血丝”，是一种面部浅层小血管及毛细血管产生扩张、增生的一种血管性皮肤疾病。中医古籍无此病记载，对其病名、病因、病机、症候及治疗，传统医学尚未达成统一认识。按照国家中医药管理局发布的《中医临床病证诊断及疗效标准》[1]，将FT 称之为“赤红面”，病因归结为心肺郁热、血行不畅，证型分血热、血瘀两证，治法以清热凉血、活血化瘀为主。消红霜是以杨文信教授多年治疗FT 的临床经验用方为基础，自主研制的一种纯中药外用面霜，由槐花、五倍子和乌梅三药组成，具有清热凉血、收敛止血之效。为探讨消红霜动物局部皮肤用药的安全性，笔者分别对大鼠、新西兰大白兔及豚鼠等动物进行了皮肤急性毒性实验、皮肤刺激性实验、皮肤致敏性实验，为消红霜的临床安全用药提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物 SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体重180 g-220 g；健康新西兰大白兔16只，雌雄各半，体重1.8 kg-2.2 kg；健康成年豚鼠30只，雌雄各半，体重260 g-300 g。以上实验动物均由西南医科大学实验动物中心提供（生产许可证号：SCXK（川）2018-17，使用许可证号：SYXK（川）2018-065），均自由饮食、饮水，并分笼饲养，室温20℃-25℃，相对湿度50%-65%，每日光照12 h。

1.2 药物 消红霜：由槐花、五倍子、乌梅组成（所有中药由西南医科大学附属中医医院中药房提供，霜剂由西南医科大学附属中医医院制剂室协助制作）；凡士林（由南昌白云药业有限公司提供，批准文号：赣食药准字F20050006）；2，4-二硝基氯化苯（由湖北万得化工有限公司提供）；生理盐水；75%医用酒精。

1.3 器材 电子天平秤、电推剪、无菌注射器、细砂纸、透明膜、无刺激性纱布、胶带。

2 实验方法

2.1 大鼠皮肤急性毒性实验 将60只SD大鼠随机分为6个组，每组各10只。具体分组情况为：消红霜完整皮肤低剂量组：涂消红霜1 g；消红霜完整皮肤高剂量组：涂消红霜3 g；消红霜破损皮肤低剂量组：涂消红霜1 g；消红霜破损皮肤高剂量组：涂消红霜3 g；完整皮肤对照组：涂凡士林3 g；破损皮肤对照组：涂凡士林3 g。给药前24 h对各组大鼠背部脊柱两侧皮肤进行脱毛处理，面积为3 cm×3 cm，脱毛处皮肤均予以75%医用酒精消毒。其中各破损皮肤组用消毒后的细砂纸，摩擦脱毛处皮肤至轻度渗血。6组大鼠均相应给药，并用无刺激性纱布覆盖及胶带固定。每隔12 h给药1次，给药后24 h用生理盐水去除受试药物。分别于去除受试药物后1 h、24 h、48 h、72 h到第14 d，观察并记录每只大鼠的体重、进食、行为、精神状态、皮肤、毛发、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应（中毒症状、症状严重程度、起始及持续时间、是否可逆）[2]。若动物死亡，及时对其进行尸检，并对可疑病变及时送检病理组织。

2.2 新西兰大白兔皮肤刺激实验

2.2.1 单次给药皮肤刺激性实验 将8只健康新西兰大白兔随机分为2个组（完整皮肤组、破损皮肤组），每组各4只。均予以脱毛处理（脊柱两侧）并消毒，脱毛面积为5 cm×5 cm。破损皮肤组脱发处皮肤用无菌注射器针头划一“井”字划痕，至表皮层轻微渗血。每组动物左侧脱毛处均匀涂抹消红霜，右侧脱毛处均匀涂抹凡士林，并用透明膜包封、无刺激性纱布覆盖、胶带固定。给药后24 h用生理盐水去除受试药物。在去除受试药物后1 h、24 h、48 h、72 h观察并记录局部皮肤有无红斑、水肿等反应及其消退情况。

2.2.2 多次给药皮肤刺激性实验 取8只健康新西兰大白兔，分组及处理方法同单次给药。每隔24 h给药一次，连续7 d。最后一次去除受试药物后1 h、24 h、48 h、72 h观察并记录局部皮肤有无红斑、水肿等反应及其消退情况。

2.2.3 评价标准 参照《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》[3]，根据新西兰大白兔皮肤红斑、水肿情况进行皮肤刺激反应评分，并计算出每组各时间节点皮肤刺激反应平均分值，公式为：刺激指数平均值=（红斑形成总分+水肿形成总分）∕动物总数。平均分值在0-0.5者为无刺激性。

2.3 豚鼠皮肤致敏性实验

2.3.1 致敏接触实验 将30只健康豚鼠随机分为3个组，分别为消红霜组、阳性对照组（2，4-二硝基氯化苯）、阴性对照组（凡士林），每组各10只。均予以脱毛处理（背部两侧），脱毛面积为4 cm×4 cm。消红霜组背部左侧脱毛处均匀涂以消红霜0.5 g，阳性对照组背部左侧脱毛处均匀涂以2，4-二硝基氯化苯0.2 mL，阴性对照组背部左侧脱毛处均匀涂以凡士林0.5 g。给药后6 h用生理盐水去除受试药物。在第7 d和第14 d各重复给药1次。

2.3.2 激发接触实验 末次致敏接触试验后，同样方法将药物分别涂于三组豚鼠背部右侧脱毛处。给药后6 h用生理盐水去除受试药物，在去除药物后0 h、24 h、48 h、72 h观察皮肤过敏反应情况。

2.3.3 评价标准 参照《药物毒理学实验方法与技术》[4]，按照皮肤红斑、水肿情况进行皮肤过敏反应评分，计算出每组豚鼠在不同时间点的致敏分值，并统计每组的致敏发生率。致敏发生率小于10%为无致敏性。

3 实验结果

3.1 皮肤急性毒性实验 在实验观察期间，各组大鼠行为、活动、饮食、毛发无明显变化。眼、耳、口、鼻未见异常分泌物，大小便正常，无死亡及中毒情况。破损皮肤组均在给药后第2天出现血痂，1周内血痂脱落痊愈。各组间体重变化情况比较无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

表1 急性毒性实验大鼠体重变化情况(±s,g)

表1 急性毒性实验大鼠体重变化情况(±s,g)

组 别消红霜完整皮肤低剂量组消红霜完整皮肤高剂量组消红霜破损皮肤低剂量组消红霜破损皮肤高剂量组完整皮肤对照组破损皮肤对照组给药前205.2±9.7 206.1±10.9 207.4±10.6 204.8±8.5 206.6±10.3 205.6±12.6除药后1 d 208.4±10.2 210.6±9.9 211.1±13.8 208.3±11.6 209.7±7.8 209.0±10.5除药后3 d 212.5±12.6 214.9±13.3 213.5±6.9 212.6±11.8 213.9±11.2 211.8±10.2除药后7 d 224.3±13.1 228.5±10.3 228.4±11.6 227.2±9.8 226.4±11.1 227.9±10.2除药后14 d 250.1±12.5 254.6±11.4 253.1±10.3 253.8±8.7 252.4±13.1 253.2±12.7

3.2 皮肤刺激实验

3.2.1 单次给药皮肤刺激性实验 单次给药后，各组动物背部两侧皮肤受试处未见红斑、水肿反应，其中破损皮肤组背部两侧受试处可见血痂，各组在各时间点的皮肤刺激反应平均分值均为0分，平均刺激强度分值＜0.5 分。提示消红霜单次给药对完整皮肤及破损皮肤均无刺激性。见表2。

表2 新西兰大白兔单次给药皮肤刺激实验结果

3.2.2 多次给药皮肤刺激性实验 各组皮肤刺激反应平均分值均为0 分，平均刺激强度分值＜0.5 分。提示消红霜多次给药对完整皮肤及破损皮肤均无刺激性。见表3。

表3 新西兰大白兔多次给药皮肤刺激实验结果

3.3 皮肤致敏性实验 在实验观察期间，消红霜组和阴性对照组受试区皮肤均未出现红斑、水肿及全身性过敏反应，过敏反应平均值为0，致敏率为0%。阳性对照组在不同观察时间点出现不同程度的红斑、水肿，致敏率为100%。提示消红霜对皮肤无致敏性。见表4。

表4 豚鼠皮肤致敏性实验结果

4 讨 论

FT 为面部浅表血管性皮肤疾病，局部皮肤给药可避免肝脏首过效应及胃肠灭活，增强疗效，减轻药物毒副作用。消红霜是在杨文信教授已取得较好临床疗效的经验方基础上，更改其剂型，采用较为成熟的制剂工艺，由槐花、五倍子、乌梅三味中药制成外用面霜。其中槐花，味苦，微寒，入肝、大肠经，具有凉血止血、清肝泻火的功效。《日华子本草》[5]曾记载槐花可治“皮肤风热，肠风泻血”。研究[6]表明槐花中的芦丁和槲皮素能维持毛细血管的正常抵抗力，通过降低毛细血管脆性及通透性，改善扩张、出血的毛细血管的弹性及功能。五倍子，具有敛汗止血、收湿敛疮的作用，常与槐花同用，以达收敛、凉血止血之效，治疗便血、痔血，也可治热灼肺络的咳嗽、咯血[7]。五倍子中的鞣酸与生物体蛋白质、多糖结合，形成一层具有收敛作用被膜，同时可压迫、收缩小血管，使血液凝固以止血[8]。此外，体外实验表明，五倍子有广谱抗菌作用，对多种细菌具有不同程度的抑制作用[9]。乌梅其性平，味酸，涩，归肝、脾、肺、大肠经，具有敛肺，涩肠，生津安蛔，止血之功。研究[10]发现乌梅具有止血、抗氧化、抗过敏的作用。有文献[11]报道，乌梅能通过抗过敏、抗菌、抗病毒、抑制小肠平滑肌的收缩作用，对荨麻疹、湿疹、哮喘、过敏性紫癜肾炎及过敏性肠炎等变态反应性疾病具有较好疗效。

本实验通过对大鼠皮肤急性毒性试验、新西兰大白兔皮肤刺激试验、豚鼠皮肤致敏性试验，证实消红霜对动物无毒性，且对动物皮肤无刺激性、无致敏性。

综上所述，消红霜动物局部皮肤用药安全性高，可作为安全、可靠的外用药进一步用于临床观察。