miR-125b和miR-335在炎症性肠病患者外周血和肠黏膜中的表达研究*

杨文宏,孙惠芳,杨 洁

(河北省秦皇岛市第一医院：1.内科ICU；2.重症医学一科；3.消化内一科 066000)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种慢性病，主要发生于机体的胃肠等消化道部位，临床病理类型主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn′s disease，CD)。最近数据资料显示，IBD的发病率在我国呈上升趋势[1-3]，给我国人民健康造成严重威胁。目前有关该疾病的病因和发病机制仍不清楚。微RNA(microRNA,miRNA)是由20个左右碱基构成的微小RNA分子，可与mRNA 3′端非编码区(3′UTR)结合，调节基因表达，参与个体发育、细胞增殖、细胞凋亡和细胞分化等生命活动过程[4-5]。已有研究表明miR-125b与miR-335可通过介导多条代谢通路影响UC和CD的发生发展[6]，但具体作用机制尚不清楚。本研究通过对IBD患者(CD患者及UC患者)外周血血清及其肠黏膜组织中miR-125b与miR-335的表达水平进行检测，分析二者与疾病活动度、病变严重程度的相关性，以期为临床研究肠道相关慢性炎症疾病提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年5月至2019年6月在本院消化内科经诊断确诊的IBD患者117例，其中CD患者62例，男35例，女27例，平均年龄(39.19±6.75)岁；UC患者55例，男34例，女21例，平均年龄(42.91±8.13)岁。纳入标准：(1)年龄20～70岁；(2)符合2012年《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》中关于UC、CD的诊断标准[7]；(3)各项检查资料完整；(4)患者及患者家属均签署知情同意书。排除标准：(1)过去3个月内使用过水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂等；(2)合并心血管疾病和肝肾疾病；(3)合并恶性肿瘤；(4)合并其他自身免疫性疾病；(5)哺乳及妊娠期妇女。同期招募健康志愿者51例(对照组)，男32例，女19例，平均年龄(40.26±6.98)岁。在肠镜下取患者黏膜2块与对照者的小肠黏膜2块置于液氮中保存备用；分别采集IBD患者与健康对照者空腹静脉血4 mL，分离血清置于冰箱备用。本研究通过本院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器

RNA提取试剂盒购自北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR®Green Mix购自南京Vazyme生物公司；实时荧光定量PCR(RT-PCR)仪购自美国Bio-Rad公司；本研究引物由西安擎科生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1RT-PCR检测miR-125b、miR-335 mRNA相对表达水平

从液氮取出肠黏膜组织及血清，采用RNA提取试剂盒(天根)提取组织及血清中的总RNA，经反转录得cDNA。采用RT-PCR仪对miR-125b和miR-335进行PCR扩增。RT-PCR反应体系共10 μL：miScript SYBR®Green Mix 5.0 μL，cDNA(50 ng/μL)1.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。反应条件：95 ℃ 90 s；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40个循环。miR-125b和miR-335及内参U6的引物序列见表1。采用2-ΔΔCT法对miR-125b、miR-335 mRNA相对表达水平进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2IBD患者的活动度、病变严重程度比较

根据改良Mayo评分标准[8]评估UC患者活动度，其中轻度活动20例(UC轻度活动组)、中度活动23例(UC中度活动组)、重度活动12例(UC重度活动组)；根据CD活动指数 (CDAI)[9]评估CD患者活动度，其中轻度活动18例(CD轻度活动组)、中度活动25例(CD中度活动组)、重度活动19例(CD重度活动组)。采用修正Baron评分系统[8]、CD 内镜严重程度指数(CDEIS)分别评估UC、CD患者内镜下病变严重程度。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 CD患者外周血血清及肠黏膜组织中miR-125b、miR-335 mRNA相对表达水平比较

与对照组比较，CD轻度活动组、CD中度活动组、CD重度活动组患者外周血血清及肠黏膜组织中miR-125b、miR-335 mRNA相对表达水平依次降低(P<0.05)，见表2。

表2 miR-125b、miR-335 mRNA在CD患者外周血血清及肠黏膜组织中的表达

2.2 UC患者外周血血清及肠黏膜组织中miR-125b、miR-335 mRNA相对表达水平比较

与对照组比较，UC轻度活动组、UC中度活动组、UC重度活动组患者外周血血清及肠黏膜组织中miR-125b、miR-335 mRNA相对表达水平依次降低(P<0.05)，见表3。

表3 miR-125b、miR-335 mRNA在UC患者外周血血清及肠黏膜组织中的表达

2.3 CD患者活动度、病变严重程度比较

CD轻度活动组、CD中度活动组、CD重度活动组患者的CDAI、CDEI均依次升高(P<0.05)，进一步两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 CD患者的CDAI、CDEI比较

2.4 UC患者活动度、病变严重程度比较

UC轻度活动组、UC中度活动组、UC重度活动组患者的改良Mayo评分、修正Baron评分均依次升高(P<0.05)，进一步两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 UC患者的改良Mayo评分和修正Baron评分的比较分)

2.5 CD患者血清miR-125b、miR-335 mRNA相对表达水平与病变严重程度及活动度的相关性

CD患者外周血血清miR-125b mRNA相对表达水平与CDAI、CDEI均呈负相关(r=-0.816、-0.829，P<0.05),见图1、2；CD患者外周血血清miR-335相对表达水平与CDAI、CDEI均呈负相关(r=-0.772、-0.501，P<0.05)。

图1 CD患者血清miR-125b mRNA相对表达水平与疾病活动度相关性分析

图2 CD患者血清miR-125b mRNA相对表达水平与病变 严重程度相关性分析

2.6 UC患者外周血血清miR-125b、miR-335 mRNA相对表达水平与病变严重程度及活动度的相关性

UC患者外周血血清miR-125b mRNA相对表达水平与改良Mayo评分和修正Baron评分均呈负相关(r=-0.729、-0.779，P<0.05)，见图5、6；UC患者外周血血清中miR-335 mRNA相对表达水平改良Mayo评分和修正Baron评分均呈负相关(r=-0.819、-0.840，P<0.05)，见图7、8。

图3 CD患者血清miR-335 mRNA相对表达水平与疾病活动度相关性分析

图4 CD患者血清miR-335 mRNA相对表达水平与病变严重程度相关性分析

图5 UC患者血清miR-125b mRNA相对表达水平与疾病活动度相关性分析

图6 UC患者血清miR-125b mRNA相对表达水平与病变严重程度相关性分析

图7 UC患者血清miR-335 mRNA相对表达水平与疾病活动度相关性分析

图8 UC患者血清miR-335 mRNA相对表达水平与病变严重程度相关性分析

3 讨 论

IBD疾病是一类非特异性肠道炎症性疾病，其病因和发病机制尚不明确[10]。近年我国该病发病率呈不断上升趋势[11]，给人们生活带来严重危害，因此对该病发病机制的研究显得尤为重要。本研究通过对本院117例IBD患者外周血血清和肠黏膜组织中miR-125b、miR-335表达情况进行检测，分析外周血血清中miR-125b与miR-335表达与疾病活动度、病变严重程度的相关性，探索miR-125b、miR-335表达对IBD发生发展的影响，以期为临床上更好地治疗和控制IBD疾病提供参考。

miRNA是一类起始于细胞核，成熟于细胞质的非编码单链RNA分子，由19～25个核苷酸组成[12]，广泛存在于真核细胞中，在哺乳动物中成熟的miRNA可对体内60%左右的基因进行调节[13]，人类基因中有2%～3%的miRNA参与体内30%左右的基因调控，miRNA在人体所有组织及血液、尿液、唾液、脑脊液等体液中均可表达，体液中miRNA与蛋白质等构成复合物，可抵抗RNA酶的降解，使得miRNA在体液中具有高度的稳定性和保守性[14]。在健康个体中miRNA的表达谱较一致，而在不同疾病状态下其表达谱可发生显著变化，这种表达谱的变化往往早于生化及影像学的改变，是早期诊断疾病的理想潜在标志物。刘嫦钦等[15]报道miR-10a在IBD疾病中表达下调，对IBD的发生发展具有重要作用。SCHÖNAUEN等[16]发现miR-16、miR-21和miR-223在IBD患者血清中高表达，参与调控IBD的发生发展。miR-31和miR-155通过直接和间接靶向IL-13依赖性途径中的基因，在IBD疾病中表达上调[17]，以上均表明多种miRNA参与IBD疾病的发生发展，但目前miR-125b、miR-335在IBD疾病中研究报道较少。miR-125b是miRNAs家族中较为活跃的成员之一，其主要分布在脑部神经元细胞和星形胶质细胞中，miR-125b在调节炎症、免疫活动和凝血方面均具有重要的作用。目前国外文献已经证明miR-125b在UC患者结肠黏膜组织中呈高表达，其可能是通过调节炎症信号通路MARK/NFkB等促进炎症细胞及相关介体的传播[18]。同时还有文献显示[19]，miR-125b与结直肠癌的发生发展及预后不良密切相关，其可作为结直肠癌的预后标志物。miR-335在人类定位与染色体7q32.2，其主要作用是调节人干细胞的增殖、迁移和分化，经过采用生物信息研究分析发现miR-335可能参与IBD过程，但是具体的机制尚不明确。而本研究发现，与健康对照者比较，轻度活动、中度活动、重度活动CD患者及UC患者外周血血清和肠黏膜组织中miR-335、miR-125b mRNA相对表达水平均明显下降，提示miR-335与miR-125b表达可能与IBD发生发展过程有关。

UC是IBD的主要类型，其发病机制可能与遗传、感染及自身免疫有关，CD是一种目前原因不明的慢性肉芽肿性炎症性疾病，异常的自身免疫可能与发病有关[20]。UC和CD的主要区别在于UC的发病部位主要在结肠和直肠，而CD可影响整个消化道[21]，且两者基因表达谱及细胞表现差异明显。本研究结果显示，UC患者外周血血清中miR-125b、miR-335 mRNA相对表达水平与Mayo评分、修正Baron评分均呈负相关；CD患者外周血血清中miR-125b、miR-335 mRNA相对表达水平与CDAI、CDEIS均呈负相关，说明外周血血清miR-125b、miR-335表达与UC患者及CD患者疾病活动度、病变严重程度均有关，提示外周血血清miR-125b、miR-335表达水平也许可作为评估UC患者及CD患者疾病活动度、病变严重程度的指标。

综上所述，miR-125b、miR-335在UC患者及CD患者外周血血清和肠黏膜组织中表达下调，miR-125b、miR-335在外周血血清中的表达与UC患者及CD患者疾病活动度和病变严重程度有关，其有望成为评估IBD疾病活动度的指标，但由于本研究样本量较少，其结论准确性尚需进一步扩充样本量加以验证。