木蝴蝶素抗脓毒症潜在靶标的筛选与鉴定

陈 意，章玲玲，叶佳丽，陈桂荣，陈赛贞，徐煜彬

0 引言

脓毒症是由于宿主对感染的反应失调，导致生命器官功能障碍[1]。脓毒症是重症监护病房(ICU)入院的主要原因之一，也是危重患者急性呼吸窘迫综合征和多器官功能障碍的主要原因。流行病学研究表明，住院患者脓毒症的发病率很高，在2011年，有57 000例严重脓毒症患者被收入124家美国学术医院，其中69%需要入住ICU，在过去10年，脓毒症是非心脏重症监护病房的第2位死亡原因，医院死亡率为47%[2-6]。随着对脓毒症流行病学、生理机制等深入研究，严重脓毒症和脓毒症休克患者死亡率逐年降低[7]，但是到目前为止，对于脓毒症并无特效药，寻找脓毒症有效药物是目前急需任务之一。

木蝴蝶素(图1)是从黄芩中提取的一种生物活性类黄酮，也是黄连解毒汤中抗脓毒症的有效成分之一[8]。研究表明，木蝴蝶素具有多种药理功能，包括抗氧化应激、抗转移、抗细胞衰老、抗肝脂肪变性、抗炎等[9-12]。木蝴蝶素在抗氧化抗炎的同时，对肝脏等器官具有保护作用，而这些作用可能会改善脓毒症症状，起到抗脓毒症作用，但是木蝴蝶素抗脓毒症的作用靶标及机制尚不明确。因此，本文基于网络大数据，采用靶标预测及验证的方法，对木蝴蝶素抗脓毒症的潜在靶标进行筛选与分析[13-15]。

图1 木蝴蝶素化学结构

1 材料

木蝴蝶素sdf格式文件，中药系统药理学分析平台(TCMSP)数据库(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，Swiss Targetprediction服务器(http://www.swisstargetprediction.ch)，DRAR-CPI服务器(https://cpi.bio-x.cn/drar)，分子对接服务器(http://systemsdock.unit.oist.jp)。

2 方法

2.1 药理参数和分子特性评价及靶标预测 首先通过TCMSP数据库对木蝴蝶素体内过程的ADME(吸收、分布、代谢和排泄)以及分子特性进行评价。

2.2 DRAR-CPI 靶标预测 DRAR-CPI服务器(https://cpi.bio-x.cn/drar)可以通过化学蛋白质相互作用分析来预测化学成分的靶向蛋白，通过从PubChem数据库下载木蝴蝶素(PubChem CID：5320315)的sdf文件，将其上传到DRAR-CPI服务器，参数为默认值，筛选Z′-score<-0.5的靶向蛋白。

2.3 Swiss Targetprediction靶标预测 登陆Swiss TargetPrediction (http://www.swisstargetprediction. ch/)服务器，在Marvin for JavaScript Version 6.1上参照PubChem数据库木蝴蝶素(PubChem CID：5320315)结构上传，对其进行靶标筛选。

2.4 木蝴蝶素抗脓毒症靶标预测 将DRAR-CPI及Swiss Targetprediction服务器预测到共有的木蝴蝶素靶向蛋白作为潜在靶标信息，与OMIM(http://www.omim.org/)、CTD(https://ctdbase.org/)和TTD(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)数据库中已报道的与脓毒症相关疾病靶标进行匹配，选择既是木蝴蝶素靶标蛋白又是脓毒症的靶标蛋白进行后续分析。

2.5 分子对接 首先将“2.1”和“2.2”涉及到的相关蛋白PDB ID输入到分子对接服务器(https://www.dockingserver.com/web/docking)，再将木蝴蝶素的sdf文件上传到服务器，点击开始对接，并对结果进行分析。

3 结果与讨论

3.1 药理参数和分子特性评价 掌握化合物的药理参数与特性能够深入地了解该化合物的成药性能，明确合适的剂型，能减少药物研发前期大量筛选操作。木蝴蝶素口服生物利用度(OB)为41.37%(>30%)，药物相似度(DL)为0.23(>0.18)，可旋转键数(RBN)为2，表明木蝴蝶素口服吸收较好，具有良好的成药性[11]。而药物半衰期(HL)为17.15，半衰期较长，能维持长时间的疗效，可以考虑做成一般口服制剂。木蝴蝶素的分子量(MW)为284.28(<500)，油水分配系数(AlogP)为2.59 (<5)，氢键供体(Hdon)为2,氢键受体(Hacc)为5,均接近5，与Lipinski[16]的5原则较为一致，成药可能性较高。

3.2 靶标预测 靶标预测是新药开发的第一步，如何明确筛选化合物的靶向蛋白已经成为药物开发的核心问题。分子反向预测靶标的计算钓靶方法也已经广泛应用于这一目的。从Swiss Targetprediction服务器筛选得到木蝴蝶素的相关靶标15个；通过DRAR-CPI共筛选出388个靶标，其中Z′<-0.5的靶标共有88个，Z′<-0.5表明具有良好的靶向性；将Swiss Targetprediction服务器和DRAR-CPI筛选到的靶标合并，删除重复靶标，总共得到97个靶标。

将“sepsis”输入到CTD、OMIM以及TTD3个数据库，从CTD筛选到26个靶标蛋白，OMIM筛选到117个靶标蛋白，TTD筛选到21个蛋白，其中共有疾病靶标149个，将木蝴蝶素预测到的97个靶标蛋白与疾病靶标进行匹配，发现既是分子靶标又是疾病靶标的蛋白有9个，分别为SERPINE1、CTSG、MIF、PROC、F9、NOS3、NOS2、ADORA1和ADORA2A，具体筛选流程见图2。

图2 木蝴蝶素靶标鉴定流程图

3.3 分子对接 本实验采用dockingserver分子对接服务器对木蝴蝶素和相关蛋白进行了分子对接。结果显示，自由结合能小于-5 kcal/mol的靶标有PROC、CTSG、MIF、NOS3、NOS2、F9、ADORA2A和ADORA1，表明木蝴蝶素具有结合这些靶标的能力[17]，结果见表1。

表1 木蝴蝶素与靶标蛋白相互作用分子对接数据

图3 木蝴蝶素与NOS3和NOS2分子相互作用

从图3可见，木蝴蝶素与NOS3的疏水相互作用残基包括ASN366、GLN247、GLU361、TYR357、PRO334、VAL336、ARG372；木蝴蝶素与NOS2的疏水相互作用残基包括ARG381、TRP463、ILE462、MET120、PHE476、TRP461、TRP90、GLU479、SER118，表明木蝴蝶素可能通过这些关键残基与NOS3和NOS2产生交互作用，从而发挥相应的药效。

脓毒症是一种危及生命的器官功能障碍，是由于宿主对入侵病原体的反应失调所致，其特征可能是全身炎症或某种免疫麻痹，严重者常常伴随着急性肺损伤，微循环障碍，细胞病变性缺氧，以及心功能障碍等[18-19]。尽管随着脓毒症机制研究的深入，开展了治疗创新，但是严重脓毒症以及脓毒症休克患者的死亡率仍然很高[20]，仍然需要寻找更多有效的治疗措施去攻克这一难题。本研究发现，木蝴蝶素可能通过结合PROC、CTSG、MIF、NOS3、NOS2、F9、ADORA2A和ADORA1起到抗脓毒症的作用。

PROC和F9都属于凝血因子，参与机体的凝血级联反应，也是血管内弥散性凝血的生物标志物，在维持血液通透性和调节抗凝方面发挥着重要作用[21-22]，同时，PROC也是重要的内皮细胞标志物[23]，而在脓毒症的发生发展中常常伴随着凝血功能紊乱以及内皮组织的损伤，因此，这两者与脓毒症密切相关，更为重要的是，PROC的水平也反映了脓毒症患者的预后情况[24]。巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是一种与急性和慢性炎症包括脓毒症、自身免疫性疾病、动脉粥样硬化、斑块不稳定和肺动脉高压有关的促炎细胞因子，也是免疫应答的重要调节因子[25]，其能促进炎症、增殖和血管生成物活性，参与感染性、炎症性以及自身免疫性疾病的发病机制，并且在脓毒症患者中高表达，也被认为是脓毒症的一个潜在生物标志物[26]。

脓毒症是由内毒素释放引发的炎症反应，常进展为难治性低血压，多器官系统衰竭和死亡。炎症反应通常是通过巨噬细胞活化和促炎细胞因子的释放来介导的，在这些信号级联诱导的介质中，NO是低血压和末端器官损伤的关键调节因子，而NO的生成则依赖于一氧化氮合成酶NOS2和NOS3[27-28]。此外，NOS2可诱导心肌抑制，NOS3可拮抗心肌抑制，两者相互平衡，在脓毒症发生心肌抑制病理生理发展过程中起着重要的作用[29]。CTSG是一种中性粒细胞蛋白弹性酶，功能类似杀菌剂，可以导致细胞和组织损伤，脓毒症发展中的器官损伤可能是由于亚毒氧化剂(超氧化物、NO等)与大量膜穿孔剂(溶血素、阳离子蛋白等)协同作用引起的，而CTSG作为亚毒性蛋白可以极大地增加这种损伤[30-31]。研究表明，腺苷受体作为炎症调控靶标是一个非常好的选择，ADORA1和ADORA2A均是G蛋白偶联受体，在机体组织细胞中介导炎症反应，调控免疫应答，在脓毒症发展进程中起着重要作用，如抑制ADORA1能降低白细胞吞噬和产生氧自由基的能力，ADORA1基因缺陷会导致促炎因子水平降低，而ADORA2A激活PKA，产生抗炎作用，在药理学上靶向治疗炎症、脓毒症、癌症、神经变性和帕金森病[32-34]。

综上所述，木蝴蝶素可能通过调节PROC和F9促进凝血系统恢复；通过调节MIF、ADORA1和ADORA2A调控免疫应答发挥抗炎作用；通过调节CTSG、NOS2和NOS3，起到保护脓毒症损伤器官的作用，最终通过缓解脓毒症整体症状和炎症等水平起到抗脓毒症作用。本研究主要通过现有的大数据对木蝴蝶素抗脓毒症的靶标进行了筛选与鉴定，但是由于数据库计算方法的缺陷，并不能确定木蝴蝶素潜在剂量的效应结果，尽管这些靶标已通过分子对接证实，但是仍需要通过体内动物实验或者体外实验进行进一步验证，但是尽管如此，本研究所使用的方法可以节约资源，减少大量靶标的筛选步骤，有助于快速有效识别木蝴蝶素的药物靶标。