葡萄糖调节蛋白94在膀胱肿瘤中的表达及其对膀胱肿瘤细胞生物学行为的影响

卢童 徐康

膀胱肿瘤是泌尿外科中最常见的恶性肿瘤[1]，其发病率在肿瘤疾病谱中居前10位[2]。膀胱尿路上皮癌是其中最常见的病理类型[3]，其有易复发、侵袭性较强的特点，严重危害人类健康。目前，在肿瘤治疗的领域里，基因治疗已成为重要的研究方向，寻找合适的靶基因进行调控则是基因治疗的重要策略之一[4]。葡萄糖调节蛋白94(glucose-regulated protein 94, GRP94)是一类重要的分子伴侣蛋白，在避免细胞进入程序性死亡，维持细胞增殖方面发挥着重要作用[5]。以往研究表明，GRP94在多种实体肿瘤中呈高表达，并与肿瘤进展密切相关[6-10]，因此具备成为肿瘤治疗靶基因的潜力。本研究中，我们检测了GRP94在膀胱肿瘤组织中的表达情况，并特异性下调GRP94在膀胱尿路上皮癌细胞株SW780内的表达，观察其对SW780细胞凋亡及迁移能力的影响，初步探讨了其作用机制。

材料与方法

一、免疫组化检测

选取2017年6月至2020年6月在我院泌尿外科因膀胱尿路上皮癌行膀胱根治性切除术患者的35例膀胱尿路上皮癌组织作为实验组，同时将此35例患者的癌旁组织作为阴性对照组，均进行免疫组化染色。基本步骤如下：所有组织经固定、石蜡包埋后制作成5 μm切片，经脱蜡入水、过氧化氢阻断并行抗原修复后，使用anti-GRP94抗体孵育，随后经洗脱、二抗孵育并显色，并在显微镜下随机选取3个视野，拍照后应用图像分析系统采集GRP94在相应组织内表达的平均光密度值。

二、小干扰RNA(small interfering RNA targeting GRP94, siGRP94)合成

本研究中设计并合成了2组小RNA，其中可靶向结合GRP94 mRNA的siGRP94序列为：正义链5′-GAAGAAGCAUCUGAUUACC-3′，反义链5′-GGUAAUCAGAUGCUUCUUC-3′，序列长度19 bp。同时设计1组长度同为19 bp，不结合任何人类基因的阴性对照小RNA，具体序列为：正义链 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′，反义链5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′。

三、细胞培养及转染

人类正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1细胞株使用含10%胎牛血清的F12K培养液，人类膀胱尿路上皮癌BIU87、SW780细胞株使用含10%胎牛血清的DMEM培养液，在37 ℃，5% CO2环境下培养。本研究中将SW780细胞分为3组进行转染，其中空白组不使用任何小RNA，阴性对照组使用阴性对照小RNA，实验组使用靶向结合GRP94序列的siGRP94。转染使用Polyplus公司生产的INTERFERin小RNA专用转染试剂，按照操作指南进行细胞反向转染，所有小RNA的转染终浓度均为25 nmol/L，转染后将细胞置于培养箱继续培养48 h。

四、Western blot检测

将SV-HUC-1、BIU87和SW780细胞培养至对数生长期后收获，经裂解、测定蛋白浓度、电泳、转膜、封闭等步骤处理后，再加入一抗孵育过夜，随后经洗脱、二抗孵育、显影，最后对蛋白条带拍照。对于接受转染实验的SW780细胞，转染后48 h，将3组细胞同时收获后重复上述步骤进行Western blot检测。本研究中采用了以下一抗检测相应蛋白表达：anti-GRP94抗体、anti-vimentin抗体、anti-caspase-9抗体、anti-Bcl-2抗体和anti-Bax抗体，内参蛋白采用β-actin。

五、流式细胞术测定凋亡率

转染后48 h，将3组细胞收获并重悬于缓冲液中，随后将Annexin V和碘化丙啶(propidium iodide, PI)加入细胞悬液内双重染色标记，并置于流式细胞仪测定凋亡率。

六、细胞迁移实验

转染后48 h，将3组细胞消化、重悬，置于显微镜下计数，各组取相同数量细胞分别置入Transwell小室，在Transwell上室内加入不含血清的培养液，下室内加入含10%胎牛血清的培养液，继续培养12 h后，将迁移至小室多孔膜下表面的细胞经固定、结晶紫染色后拍照，随后使用等量冰醋酸将着色于各组迁移细胞的结晶紫洗脱，并测定各组洗脱液的光密度值，使用下列公式计算实验组和阴性对照组的细胞迁移抑制率：迁移抑制率=(1-各组光密度值/空白组光密度值)×100%。

七、统计学方法

本研究使用SPSS 19.0软件进行统计分析，多组间计量资料应用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，结果以均值±标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、GRP94在膀胱尿路上皮癌内呈高表达

如图1所示，免疫组化染色后，镜下可见GRP94在癌旁组织的膀胱上皮及膀胱尿路上皮癌组织内均呈棕黄色颗粒状着色，主要表达于细胞质内，并有少量表达于细胞膜，经图像分析系统检测，35例尿路上皮癌组织中GRP94表达的平均光密度值为0.570 8±0.050 9，35例癌旁组织中GRP94表达的平均光密度值为0.269 7±0.024 6，膀胱尿路上皮癌组织内的GRP94表达强度明显高于癌旁组织(P<0.01)。

A：两组GRP94的免疫组化染色图(SABC法，×100)；B：两组GRP94表达的平均光密度值(*与阴性对照组比较，P<0.01)图1 免疫组化检测GRP94在膀胱尿路上皮癌(实验组)和癌旁组织(阴性对照组)中的表达

二、GRP94在SW780细胞中呈高表达

如图2所示，GRP94在膀胱尿路上皮癌SW780和BIU87细胞株中呈高表达，表达量明显高于正常膀胱上皮细胞株SV-HUC-1(P<0.01)，此外，SW780细胞中GRP94的表达量明显高于BIU87细胞(P<0.01)。因此在后续siGRP94转染实验中采用GRP94表达量相对最高的SW780细胞。

A：不同细胞株内GRP94的蛋白免疫印迹；B：不同细胞株内GRP94的相对表达量(*与SV-HUC-1比较，P<0.01；#与BIU87比较，P<0.01)图2 Western blot检测SV-HUC-1、BIU87和SW780细胞内GRP94的表达

三、siGRP94可有效下调SW780细胞内GRP94的表达

将siGRP94和阴性对照RNA转染导入SW780细胞后，采用Western blot检测3组细胞内GRP94的蛋白表达情况，可见转染siGRP94的实验组GRP94表达量较空白组和阴性对照组明显下调(图3，P<0.01)。

A：3组细胞内GRP94的蛋白免疫印迹；B：3组细胞内GRP94的相对表达量(*与空白组和阴性对照组比较，P<0.01)图3 Western blot检测3组SW780细胞内GRP94的表达

四、下调GRP94表达可诱导SW780细胞凋亡

转染后48 h，采用Annexin V +PI双重染色法标记3组细胞，并使用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率(图4)，其中转染了siGRP94的实验组SW780细胞凋亡率为(16.58±0.64)%，空白组和阴性对照组凋亡率分别为(5.25±0.26)%和(5.78±0.58)%，实验组凋亡率明显高于空白组和阴性对照组(P<0.01)。

A：3组细胞的凋亡散点图(各组右上和右下象限所示为凋亡细胞)；B：3组细胞的凋亡率(*与空白组和阴性对照组比较，P<0.01)图4 流式细胞术检测3组SW780细胞的凋亡率

五、下调GRP94表达可抑制SW780细胞迁移能力

转染后48 h，采用Transwell法检测3组细胞的迁移能力，可见转染了siGRP94的实验组中，迁移至Transwell小室多孔膜下表面的SW780细胞数明显少于空白组和阴性对照组(图5)，将着色于各组迁移细胞的结晶紫洗脱后，测量洗脱液光密度值并与空白组洗脱液光密度值比，同时并计算细胞迁移抑制率，其中实验组迁移抑制率为(52.15±3.36)%，阴性对照组为(4.47±1.23)%，实验组SW780细胞迁移能力明显下降(P<0.01)。

A：3组迁移细胞的结晶紫染色图(×400)；B：3组细胞的迁移抑制率(*与阴性对照组比较，P<0.01)图5 Transwell小室检测3组SW780细胞迁移能力

六、下调GRP94表达影响SW780细胞内凋亡调控和迁移能力相关蛋白表达

采用Western blot法检测3组细胞内vimentin、caspase-9、Bcl-2、Bax的表达情况，如图6所示，实验组迁移能力相关蛋白vimentin表达明显下调(P<0.01)；凋亡调控蛋白中，caspase-9前体表达下调，同时caspase-9剪切体表达上调(P<0.01)，Bcl-2表达下调，同时Bax表达上调(P<0.01)。

讨 论

作为膀胱肿瘤最常见的病理类型，尿路上皮癌由于其较强的增殖、复发和侵袭能力成为治疗肿瘤的难点，寻找合适的靶基因进行调控则是治疗此类肿瘤的一个重要策略。GRP94又名热休克蛋白GP96，由HSP90b1基因编码，为热休克蛋白90家族的重要成员[5]，是分子结构上高度保守的内质网驻留糖蛋白，具有4个主要结构域，可与新生多肽链形成复合物并协助其装配和折叠[11]。内质网是一类重要的核周细胞器，其分泌合成30%以上的细胞内功能蛋白，同时也在细胞内钙离子的存储以及碳水化合物等物质的代谢过程中发挥关键作用。诸如GRP94一类的内质网驻留蛋白可以协助新合成的多肽链折叠成正确的构象并发挥其生理功能。正常情况下，由于细胞周期的严密调控，GRP94的表达始终控制在一定的范围内，而肿瘤组织由于其快速生长的特点，细胞多处于低糖、缺氧、高酸性的环境中，此时许多新生成的多肽链会发生错误折叠或未折叠的现象，并大量聚集在内质网，使其进入内质网应激状态并诱发未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)。此时，为应对UPR和内质网应激，细胞会经过蛋白激酶R样内质网激酶通路等调控方式上调GRP94的表达，协助内质网新生蛋白进行折叠，从而减轻内质网应激，维护细胞内环境稳态，进而避免细胞凋亡[12-13]。因此，GRP94在宫颈癌、食管癌、肝癌及乳腺癌等多种实体肿瘤组织中呈高表达，并表现出明显促进肿瘤增殖和进展的作用[14-18]，但GRP94在膀胱肿瘤组织中的表达及其对膀胱肿瘤细胞生物学行为的影响目前罕有报道。本研究中，我们采用免疫组化方法分别检测了膀胱尿路上皮癌和其癌旁组织中GRP94的表达，结果显示，肿瘤组织中GRP94表达的平均光密度值明显高于癌旁组织，说明GRP94在膀胱肿瘤中表达上调。同时，我们检测了膀胱正常上皮细胞SV-HUC-1细胞株和膀胱尿路上皮癌BIU87、SW780细胞株中GRP94的表达水平，同样显示膀胱肿瘤细胞株中GRP94表达较正常膀胱上皮细胞明显上调。结合GRP94的功能来看，这种表达上调可能与维持膀胱肿瘤细胞的生存等生物行为有关。

A：3组细胞内凋亡和迁移相关蛋白的蛋白免疫印迹；B：3组细胞内vimentin相对表达量；C:3组细胞内caspase-9前体相对表达量；D：3组细胞内caspase-9剪切体相对表达量；E:3组细胞内Bcl-2相对表达量；F:3组细胞内Bax相对表达量(*与空白组和阴性对照组比较，P<0.01)图6 Western blot检测3组SW780细胞内凋亡调控和迁移能力相关蛋白表达

为进一步验证GRP94与膀胱肿瘤细胞生物学行为的关系，我们尝试将特异性下调GRP94表达的siGRP94导入膀胱尿路上皮癌细胞中。本研究中，我们选取了GRP94表达量相对较高的SW780细胞株接受siGRP94转染。结果发现，SW780细胞内GRP94表达下调后，肿瘤细胞的凋亡率明显上升，而迁移能力则明显下降。近年来相关研究也表明，下调GRP94的表达可诱导宫颈癌、食管癌、肝癌及乳腺癌等肿瘤细胞发生凋亡并抑制其迁移或侵袭能力[14-18]。因此可以认为GRP94在维持包括膀胱肿瘤在内的多种肿瘤细胞的生存及侵袭迁移能力方面发挥着重要作用。

为探讨下调GRP94影响膀胱肿瘤细胞生物学行为的可能机制，我们检测了SW780细胞内部分凋亡调控及迁移相关蛋白的表达情况，结果显示，下调GRP94表达可诱导Bcl-2表达下调和Bax表达上调，进一步诱导细胞内caspase-9开始激活，因此可推测下调GRP94表达是通过诱导细胞进入线粒体凋亡途径从而促进膀胱肿瘤细胞凋亡。同时，我们还发现SW780细胞的vimentin表达下调，由于vimentin是维持细胞骨架的重要蛋白,并在肿瘤细胞的黏附和迁移过程中发挥重要作用[19-21]，因此该蛋白的下调可能是导致SW780细胞迁移能力下降的重要原因，但目前尚不明确其具体机制，需进一步研究。