四季栀子的生物学特性及亲缘关系

王一帆, 张晓华, 陈清海, 苏宝川, 连其祥, 邹双全, 孙维红, 邱梦媛

(1.福建农林大学林学院，福建 福州 350002；2.自然生物资源保育利用福建高校工程技术研究中心，福建福州 350002；3.泉州市林业局，福建 泉州 362000；4.寿宁县林业局种苗站，福建 寿宁 355500)

栀子(GardeniajasminoidesEllis)为茜草科(Rubiaceae)栀子属(Gardenia)常绿灌木，是极具潜力的观赏及经济价值植物，同时也是列入国家植物新品种权保护与审定主要林木品种目录的物种.目前关于栀子的研究主要集中于化学成分提取及药理作用方面[1]，同时对栀子培育管理方面也进行了相关研究[2]，但未查阅到有关栀子品种的《植物新品种DUS测试指南》，缺少具体的等级划分范围和级差，这在一定程度上影响了栀子新品种的选育工作.2017年中国园林网报道了一种浙江栀子新品种——‘栀香富润’，其枝型紧凑，叶小、花量多、不结果、味香甜，有枝条生长就有花苞，花期长达180 d以上，从5月中旬开至11月底，在大棚暖房内的花期可达250 d以上[3].目前，还没有关于福建栀子新品种的报道.

植物新品种鉴定的基本原则是：品种具有特异性、一致性和稳定性[4].目前关于品种鉴定常用的方法有形态学鉴定法、生化鉴定法和分子标记法[5].形态学鉴定是通过植物的外部特征来区分不同的植物[6]，如植株叶片大小、叶片颜色、花瓣数、萼片数、果实颜色等.根据表型性状来检测遗传多样性是最为直接和简便易行的方法，这种方法具有简便、经济和高效等特点[7]，是专家学者们在植物种质资源鉴定及育种材料的选择上广泛运用的一种重要方法.目前，已有采用形态学方法鉴别栀子的研究[8]，但形态学鉴定易受环境因素和植物不同发育时期的影响，存在一定的局限性，不能真实反映遗传变异.而分子标记是以个体间碱基水平的差异作为依据[9]，能克服形态标记的缺点，因此是研究物种、种间和种内遗传多样性及品种间亲缘关系鉴定的有效方法.目前对于栀子亲缘关系的研究主要采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术[10]和简单重复序列间扩增(ISSR)技术[11]，但尚未见单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)用于栀子研究的报道.SNP与其他分子标记相比具有更多的优点，如SNP在基因组中分布广、数量多、稳定性强，具有二态性和等位基因，可通过测序直接进行不同个体间的序列对比[12-13].

2014年本课题组于福建省清流县发现一种常年开花的栀子新资源，其花期长达286 d以上，暂定植物名为四季栀子.目前，国内外还没有关于四季栀子的研究，为了验证四季栀子是否为本地栀子变异种的猜想，以及与‘栀香富润’的区别，本研究对四季栀子的生物学特性以及与相近种的亲缘关系进行了分析，希望能为区别不同栀子资源提供理论支持，也为栀子优良性状的挖掘开发提供参考，这对促进福建栀子新品种选育及具有自主知识产权的乡土药用和观赏植物的开发具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 材料来源

试验材料为清流10多年生四季栀子母株、2年生四季栀子扦插植株、清流栀子和浙江栀子‘栀香富润’.

试验地位于清流县南部(北纬25°50′42″，东经116°47′50″)，地处中低纬度，四季分明，属亚热带季风气候，昼夜温差大, 年平均气温16.5～18.0 ℃，1月份平均气温5.2～5.7 ℃，极端最低气温-12.8 ℃，7月份平均气温27.1～28.1 ℃， 极端最高气温39.9 ℃，年降水量1 700～2 000 mm， 无霜期230～280 d，年日照时数1 720～1 745 h[14].该区秋冬季多西北风，春夏季多东南风，全年温暖湿润；土壤类型属于粗骨性红壤，pH 4.56，含0.82 g·kg-1全磷、3.60 μg·mL-1全钾、134 g·kg-1碱解氮、10.79 mg·kg-1有效磷、133 μg·kg-1速效钾，土壤基础肥力较低.

1.2 方法

1.2.1 生物学特性和表型的观测 于2017年10月至2018年12月，以四季栀子、清流栀子和‘栀香富润’为研究材料，选择具有代表性的植株各3株，包括1株四季栀子母株和2株四季栀子扦插植株，共9株，分别挂牌，统一编号，期间于每月中旬记录挂果数、开花量、开花期、抽梢期和挂果期，观测叶片和花的表型性状，包括叶色、叶长、叶宽、花朵形态、叶柄长度、节间距等.

于2018年9月，从9株栀子上各选取20片当年生生长良好、无病虫害的健康叶片，拍照并记录叶片的颜色和形状.用叶面积扫描仪测量叶面积、叶长和叶宽等指标(精确到0.1 cm)，用游标卡尺测量叶柄长度(精确到0.01 cm).

1.2.2 SNP分子标记的测序 采集9株栀子当年生健康无病虫害的新生嫩叶[15]，采用改良后的CTAB法[16]提取基因组DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格的DNA采用简化的基因组测序技术(genotyping-by-sequencing, GBS)构建基因文库.文库构建时采用内切酶ApeKⅠ(ApeKⅠ的酶切识别位点为CWGC，其中，W指A和T的简并碱基)对基因组DNA进行酶切.GBS 建库流程：(1)利用ApeKⅠ限制性内切酶消化基因组DNA；(2)酶切后加入特异设计的P1标签接头和P2常规接头进行连接反应，接头连接后用Qubit荧光定量仪对各样本进行定量；(3)将9个样本的DNA等量混合后纯化产物；(4)不同长度序列的PCR扩增效率不同，通过PCR扩增后，片段大小集中在180～480 bp；(5)文库纯化，并进行质检，合格后上机测序.

1.3 数据处理

1.3.1 物候期观察统计 统计开花期、抽梢期和挂果期，并记录期间的开花量和挂果数，用Excel 2016软件整理.开花期：记录每株栀子从第一朵花开放到最后一朵花开毕的日期.抽梢期：记录从叶芽抽新梢到封顶形成休眠芽的日期.挂果期：记录从开始坐果到果实进入完熟期的日期.

1.3.2 叶表型数据处理 叶表型的所有原始数据(叶色、叶面积、叶长、叶宽)用Excel 2016软件整理，SPSS 18.0软件进行主成分和聚类分析.本研究选用标准差对数据进行标准化，在此基础上作进一步分析.为探讨不同种质间表型性状的整体相似性，采用Q型聚类法和类平均链锁法，距离为欧式距离，构建树状聚类图.

1.3.3 SNP标记数据处理 SNP分子标记测序得到的原始数据可能包含低质量序列和接头序列等.为了保证信息分析结果的可靠性，需要进行一系列数据处理来过滤原始数据，得到干净数据.具体步骤如下：(1)去除原始数据中序列5′端未包含样本标签(4～8 bp)信息的测序片段(一个样本对应一个标签)；(2)将上述片段剪切掉5′端标签后，进行酶切识别位点的过滤，如果剪切掉标签的片段5′端未含酶切识别位点，则去除该片段；(3)拆分后的数据去除含接头的片段；(4)拆分后的数据去除含低质量的片段(质量值≤15的碱基数占整条测序片段的40%以上)；(5)拆分后的数据去除含N(表示无法确定碱基信息)比例>10%的片段.

通过以上步骤得到干净数据，从中筛选出适合的SNP序列，并使用Treebest NJ软件作图.

2 结果与分析

2.1 四季栀子与其他栀子的生物学特性和表型特征比较

2.1.1 四季栀子的特异性 特异性指通过长期选育的品种与原生种具有明显区别，如果一个品种的性状差异恒定且明显，则认为该品种具有明显差异[17].通过比较四季栀子与清流栀子两份种质资源的表型特征和物候期(表1、图1)得出以下结果.(1)花期：四季栀子扦插植株与清流栀子的花期差异明显，清流栀子花期在5—8月，四季栀子扦插植株花期在3—12月，四季栀子母株的花期长达12个月；(2)挂果期：四季栀子挂果期为10—12月，清流栀子的挂果期为8—10月；(3)抽梢期：四季栀子全年抽梢，清流栀子抽梢期为3—7月；(4)花的形态特征：四季栀子具有单瓣和重瓣花，清流栀子的花朵仅为单瓣；(5)叶在枝条上的着生方式：四季栀子的叶为3叶轮生，清流栀子的叶为对生.综上，四季栀子与清流栀子相比具有明显的特异性.

图1 不同栀子材料的表型特征Fig.1 Phenotypic characteristics of different gardenia materials

表1 试验材料的编号、来源、表型特征和物候期Table 1 Number, origin and phenotypic characteristics of the experimental materials

2.1.2 四季栀子的一致性和稳定性 一致性是指新品种经过繁殖，其子代除可以预见的变异外，其相关的特征或者特性保持一致[17].稳定性是指新品种经过反复繁殖后或者在特定繁殖周期结束时，其相关的特征或者特性保持不变[18].在两个测试周期内，分别对四季栀子扦插繁育子代的花和叶片的表现性状及花期等多个性状进行统计.结果(表2)显示：各扦插植株开花量为5.67～6.15朵，差异不显著；花瓣长宽比为1.6～1.9，花期286～317 d，叶长4.7～4.9 cm，叶宽2.1～2.3 cm，各植株的花期均不小于286 d.各性状的变异系数为1.66%～7.64%，均小于10%，表明四季栀子扦插繁育子代表型差异的幅度小.可见，四季栀子经过无性繁育，其后代的表型性状具备一致性和稳定性.

表2 四季栀子扦插植株的性状Table 2 Traits of four-season gardenia cuttings

2.2 栀子叶表型标记

2.2.1 栀子叶表型的变异特征 对四季栀子、清流栀子和‘栀香富润’的叶面积、叶长、叶宽、叶片长宽比、节间距和叶柄长度 6个性状进行描述性统计.结果(表3)显示，不同栀子材料表型性状的变异系数为15.93%～89.42%，表明群体间的表型性状差异幅度大.叶柄长度为0.20～2.39 cm，变异系数达到89.42%，节间距为0.56～7.10 cm，变异系数达到61.11%，表明群体间的叶柄长度和节间距差异显著；叶面积为8.46～14.98 cm2，变异系数达到21.67% ，表明群体间的叶片大小差异明显；叶长、叶宽和叶面积的变异系数明显大于叶片长宽比的变异系数，表明虽然群体间的叶片大小存在差异，但叶形较为稳定.

表3 试验材料的表型性状Table 3 Phenotypic traits of the experimental materials

2.2.2 栀子叶的表型特征 主成分分析可以较准确地反映栀子的表型特征，主成分的特征值和贡献率是选择主成分的依据，其各变量的特征值越大，则表明此成分的贡献率越大[19].分析结果(表4)表明，通过主成分分析共提取2个主成分，性状特征值分别为3.516和1.335，均大于1，主成分2的累计贡献率为80.8379%(≥70%).其中，主成分1主要是反映栀子生长情况的指标，以叶长和叶片长宽比为主分量；主成分2是反映叶柄长度形态的指标.表明叶长、叶片长宽比和叶柄长度3个性状对栀子的表型分类比较重要，其余性状的贡献率较低.

表4 两个主成分的负荷量、特征值、贡献率和累计贡献率Table 4 Factor loading, eigen value, contribution rate and cumulative contribution rate of the 2 principal components

2.3 栀子的SNP标记

SNP指的是由单个核苷酸——A、T、C、G的改变而引起的DNA序列的改变，造成物种之间基因组的多样性.为揭示四季栀子单核苷酸变异的信息，应用Stacks软件对SNP位点进行统计分析.结果(表5)显示：9个样本测得的SNP总数以杂合型SNP为主，杂合率>50%，只有QS-2和QS-3纯合型较多，分别占60.12%、69.23%；SNP总数最大的是QL-1，为179 653个，其次是ZJ-2，为15 660个，QS-2的总数最小，为23 514个；杂合型SNP占SNP总数比例最高的是ZJ-2，达到86.24%，比例最低的是QL-3，为30.77%.

表5 试验材料SNP结果的统计表Table 5 Statistics on the SNP results of the experimental materials

2.4 栀子的聚类分析

图2b表明，当标尺值为20时，基于叶表型性状的聚类结果可以将9个不同来源的栀子分为Ⅰ和Ⅱ类两大类.Ⅰ类为清流栀子(QL-1、QL-2、QL-3)，Ⅱ类为浙江采集的‘栀香富润’(ZJ-1、ZJ-2、ZJ-3)和清流采集的四季栀子(QS-1、QS-2、QS-3)，基于叶表型的Q型聚类能将浙江和清流采集的种质给区分开.基于SNP位点的聚类也能将浙江和清流采集的种质区分开(图2a)，然而与基于叶表型的聚类结果(图2b)不同的是，QL-3与QL-1、QL-2并不是如图2b所示的分开聚为一小类，而是QL-3位于QS-1和QS-3之外，单独聚为一支；而QS-2则是位于QL-1和QL-2之外，单独聚为一支.

a：基于SNP位点的树状聚类图；b：基于叶表型Q型聚类分析的树状聚类图.图2 不同栀子材料种间的亲缘关系Fig.2 Phylogenetic map of different gardenia materials

3 讨论与结论

本研究鉴定了四季栀子是否具有特异性、一致性和稳定性，结果表明，四季栀子与清流栀子在花的形态特征、花期、挂果期和抽梢期等方面存在明显差异.其中，花期差异最大，四季栀子的花期长达286～317 d，与清流栀子60 d左右的花期相比，花期长度的特异性极其显著，表明四季栀子具备品种特异性.四季栀子无性系子代与母株的表型和生物学特性无明显差异，花朵均为白色单瓣花，偶尔出现重瓣花.初步认定四季栀子具备植物新品种的一致性和稳定性，是极具开发应用的新资源.

本研究对9个样本中差异较为明显的叶表型进行分析的结果显示，样本各性状指标的变异系数为15.93%～89.42% ，表明样本内表型差异的幅度大.叶柄长度的变异系数最大(89.42%)，叶片长宽比的变异系数最小(15.93%)，表明叶形较为稳定.从6个叶表型性状中提取2个主成分，性状的特征值均大于1，主成分2的累计贡献率为80.838%(≥70%).反映了叶长、叶片长宽比和叶柄长度3个性状对栀子的表型分类比较重要.

表型聚类能够将清流的本地种、四季栀子和浙江采集的‘栀香富润’区分开来.在基于SNP位点的聚类图中，浙江和清流两地的种质被清楚地区分开，而清流栀子和四季栀子并不像表型聚类图那样被明显地区分开，表明清流本地野生栀子与四季栀子具有更近的亲源关系.两种聚类结果的差异，表明表型鉴定对亲缘关系的鉴定具有一定的参考价值，但表型性状易受到植物生境等多方面的影响产生变异.

综上，初步认定四季栀子具有特异性、一致性和稳定性，且相对于‘栀香富润’，与清流栀子的亲缘关系更近，初步推定为清流当地栀子变种.本研究在基于前人研究的基础上，对四季栀子和清流栀子的12个数量性状进行了测定，对栀子新品种测试具有一定的指导意义，但因栽培条件、年份、品种内变异、气候环境变化等因素存在的不确定性，应将大量的年度间数据进行集中分析，同时选择稳定且具有典型性状特征的标准品种作为参照，对年度间的数据进行校对和修订，从而确保品种测试的客观性与合理性.