烟酰胺单核苷酸对内毒素休克小鼠死亡率的影响

汪东昇，郑斯莉，程明和，缪朝玉 （海军军医大学药理学教研室，上海 200433）

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）是一种经典辅酶，对线粒体电子转移反应至关重要，在许多生物学功能中起着关键作用[1]。烟酰胺单核苷酸（NMN）是NAD 生物合成的关键中间体。NMN 在心脑血管疾病、肝肾功能、血管和内皮功能，以及免疫和炎症、衰老等各类疾病治疗方面都具有相当强的潜力[2]，常被人称为“万能药”。NMN 能够通过口服、静脉注射、腹腔注射（小鼠）等多种给药途径进入体内，通常具有较高的安全性。在急性毒性实验中，小鼠连续7 d 给予最大灌胃剂量和饱和浓度的NMN，每天1 次，耐受性良好，除血清丙氨酸氨基转移酶略有升高外，其余生物标志物基本保持不变，而相同处理条件下的比格犬，会有轻度的肌酐和尿酸升高[3]；在长期给药实验中，小鼠连续12 个月给予100 和300 mg/kg 的NMN，均未出现不良反应[4]。在出血性休克治疗方面，对出血性休克大鼠模型，术前连续5 d 的NMN 饮水给药和术后静脉推注NMN 均能缩短休克复苏时间和提高复苏后的存活率[5]。据报道[6-9]，在炎症治疗方面，NMN 及相关代谢产物烟酰胺核糖、烟酰胺都具有一定抗炎作用。

内毒素休克是由感染引起的全身炎症反应综合征，会导致各系统衰竭，包括循环系统、呼吸系统、血液系统，损害肝脏和肾脏功能[10]。相关研究显示，最佳的治疗时间在发病6 h 内，能够提高患者的生存率，降低病死率[11]。目前临床内毒素休克以药物治疗为主（如血管活性药物、激素、抗菌素等）[12]，同时辅以液体复苏、脑神经保护、吸氧等常规治疗。为便于对内毒素休克开展研究治疗，通常使用LPS 进行内毒素休克动物造模，LPS 是G-菌细胞壁外膜上的主要成分，也叫内毒素，能引起严重的炎症级联反应，是G-菌的主要致病成分之一[13]。

目前，NMN 对内毒素休克的治疗作用尚未知。本研究旨在探究NMN 对LPS 诱导的内毒素休克小鼠模型的死亡率影响，为阐明NMN 在内毒素休克治疗方面的作用提供线索。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器

烟酰胺单核苷酸[NMN，纯度≥95%，−25～−15 ℃保存，邦泰生物工程（深圳）有限公司]；烟酰胺单核苷酸[NMN～，纯度≥95%，2～8 ℃保存，尚科生物医药（上海）有限公司]；脂多糖（LPS，美国Sigma 公司）；BT25S 精密电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；独立通风系统（上海鸣励实验室科技发展有限公司）。

1.2 实验动物

SPF 级8 周龄雄性C57BL/6J 小鼠(西普尔-必凯实验动物有限公司)。实验前在相对洁净的环境下使用独立通风系统，将动物适应性饲养2 周。期间动物自由饮水、进食。笼具内温度22～26 ℃、湿度40%～70%，笼内维持正压20～25 Pa，每小时换气次数60～70 次，室内明暗交替12 h（8:00～20:00 照明）。

1.3 动物分组、模型制备与给药处理

根据不同实验目的，将C57BL/6J 小鼠随机分为给药组和对照组。腹腔注射LPS（10 mg/kg）进行内毒素休克造模，在造模前或者造模后进行NMN 腹腔注射给药，给药方式分为单次给药和两次给药方式。具体分成5 个实验：①造模后0.5 h给药，剂量为10、30、100、300 mg/kg；②造模前0.5 h给药，剂量为30、100、300、600 mg/kg；③造模后0.5 h 和12 h 两次给药，每次300 mg/kg；④造模后0.5 h 和12 h 分别用2 种不同厂家的NMN 给药，剂量为300 mg/kg；⑤造模前0.5 h 用不同厂家的NMN 给药，剂量为300 mg/kg。

1.4 统计方法

使用Log-rank 检验，对给药组和溶剂对照组的生存曲线进行比较，P＜0.05 为差异有统计学意义，使用GraphPad Prism8 软件对数据进行统计分析。

2 结果

2.1 LPS 造模后0.5 h 单次给予NMN 无明显治疗作用

如图1 所示，LPS 造模后0.5 h 给予300 mg/kg NMN 组小鼠首次出现死亡的时间比生理盐水组更早，整个观察期间给药组小鼠死亡的总体趋势要稍快于生理盐水组，且在观察末期存活的动物数量略少。但两组生存曲线之间比较无统计学差异（P=0.216 1）。因此，LPS 造模后0.5 h 给予300 mg/kg NMN 不具有治疗内毒素休克的作用，甚至有轻微增加内毒素休克死亡率的趋势。

图1 LPS 造模后300 mg/kg NMN 单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响（n=10）

实验进一步考察了LPS 造模后0.5 h 给予多个不同剂量NMN 对内毒素休克死亡率的影响，如图2所示，与生理盐水组相比，10、30、100、300 mg/kg NMN 给药组的小鼠首次出现死亡的时间均接近，各组中位生存时间：300、100、30、10 mg/kg 给药组分别为51、55、41 和38 h，生理盐水组为37 h。整个观察期间NMN 给药各组死亡速度较生理盐水组稍缓，其中放缓趋势最明显的是100 mg/kg 剂量组，但均不具有统计学意义（P=0.433 4），表明小鼠在LPS 造模后0.5 h 单次给予NMN 不能改善内毒素休克死亡率或减缓死亡速度。

2.2 LPS 造模前0.5 h 单次给予NMN 无明显治疗作用

图2 LPS 造模后不同剂量NMN 单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响（n=14）

在LPS 造模前0.5 h 进行NMN 给药。如图3所示，300 mg/kg NMN 预防给药组小鼠首次出现死亡的时间稍早于生理盐水组，而2 组死亡的总体趋势相近，前者的中位生存时间为83 h，后者为91 h，生存曲线比较无统计学差异（P=0.594 6），故LPS造模前0.5 h 给予300 mg/kg NMN 不能改善内毒素休克小鼠的死亡率，不具有防治作用。

图3 LPS 造模前300 mg/kg NMN 单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响

随后又进行多个不同剂量NMN 单次预给药实验。如图4 所示，NMN 30、100、300、600 mg/kg组与生理盐水组小鼠首次出现死亡的时间均相近，之后各组死亡趋势也类似，各组中位生存时间分别是：NMN 给药组30 mg/kg 为34 h、100 mg/kg 为43 h、300 mg/kg 为40 h、600 mg/kg 为55 h，生理盐水组为37 h，各组生存曲线也无统计学意义。结果表明，在造模前进行NMN 单次预给药对于LPS 构建的内毒素休克模型无明显改善生存率的作用。

图4 LPS 造模前不同剂量NMN 单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响（n=15）

2.3 LPS 造模后0.5 h 和12 h 两次给予NMN 增加内毒素休克死亡率

考虑到NMN 在体内的代谢速度较快，能够迅速入血进入各个组织器官并代谢为活性分子NAD，而NAD 被证明在多种炎症性疾病中具有保护作用，因此，观察NMN 的2 次给药是否对内毒素休克有治疗效果。

如图5 所示，2 次重复实验结果均表明，LPS 造模后0.5 h 和12 h，给予2 次NMN（每次300 mg/kg）治疗组小鼠其首次出现死亡的时间早于生理盐水组；之后，NMN 治疗组小鼠死亡速度明显快于对照组，且观察末期NMN 治疗组小鼠存活率不及对照组一半，2 次重复实验的生存曲线间均具有统计学差异（P=0.040 4；P=0.003 8）。因此，该结果表明，LPS 造模后2 次NMN 给药明显增加小鼠内毒素休克死亡率。

2.4 不同厂家NMN 对LPS 引起的内毒素休克的作用基本相同

图5 LPS 造模后两次NMN 给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响（n=10）

不同厂家生产的NMN 因药物纯度、杂质成分不同等，可能导致治疗效果有差别。为排除非药物分子本身因素如厂家生产工艺因素，进一步明确上述NMN 治疗内毒素休克的作用，接着引入另一厂家生产的NMN（以下均简称NMN～），并同时测试比较两家NMN 产品治疗内毒素休克的效果。

实验首先对LPS 造模后0.5 h 和12 h 的2 次给予NMN（每次300 mg/kg）增加内毒素休克死亡率的作用进行了验证。如图6 所示，NMN 给药组和NMN～给药组这2 组小鼠首次出现死亡的时间和观察末期小鼠存活数都接近，整个观察期小鼠死亡趋势非常相似，与生理盐水对照组相比，两组都明显加重内毒素休克小鼠的死亡率，与对照组的生存曲线间均有统计学差异（P=0.049 9；P=0.026 0）。3 组中位生存时间分别是：NMN 给药组57.5 h、NMN～给药组51.5 h、生理盐水组106.5 h。此外，该结果与上述单个NMN 产品连续2 次给药效果类似（图5）。因此，两家NMN 产品效果基本相同，也进一步证明了LPS 造模后0.5 h 和12 h 的2 次给予NMN（每次300 mg/kg）确实可加重内毒素休克病情，加速小鼠的死亡。

图6 不同厂家NMN 两次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=14)*P＜0.05，与生理盐水组比较。

最后，实验又考察了两家NMN 产品预防给药效果，即在LPS 造模前0.5 h 进行NMN 或NMN～给药。如图7 所示，NMN 组、NMN～组、生理盐水组3 组小鼠首次出现死亡的时间及之后每组小鼠死亡的速度都相近，直至每组均剩20%小鼠存活（第71 小时）。之后，生理盐水组小鼠不再死亡，而NMN 组、NMN～组小鼠陆续死亡殆尽。3 组中位生存时间分别是：NMN 给药组40 h、NMN～给药组45 h、生理盐水组37 h。可见，两家NMN 产品作用相似，对LPS 所致的内毒素休克无治疗效果，且与生理盐水组比较时均有加重内毒素休克死亡率的趋势，但是均无统计学意义（P=0.644 7；P=0.972 5）。该结果与上述NMN 单次预防给药的实验结果相一致(图3 和图4)。

图7 不同厂家NMN 预防给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=15)

3 讨论和总结

目前NMN 是保健品领域的开发热点，以抗衰老以及各类疾病治疗作用为目的，在国内外已有不少人开始服用NMN[14]。但是NMN 对内毒素休克的作用尚未知，对患有这种疾病的患者能否服用NMN 亦不清楚。

根据现有的研究报道，NMN 在小鼠疾病模型其腹腔注射给药的有效剂量为10～600 mg/kg[2,4]。本实验中，我们测试了不同NMN 剂量尤其是300 mg/kg 时对小鼠内毒素休克的治疗效果，结果显示，小鼠在LPS 造模后0.5 h 或造模前0.5 h 单次给予不同剂量NMN 均无明显改善生存率的作用，不具有治疗效果；甚至在LPS 造模后两次NMN 给药明显增加小鼠内毒素休克死亡率。为排除厂家生产工艺等因素，我们又同时用两个厂家生产的NMN 产品进行实验，以重复上述结果，最终再次证明LPS 造模后两次给予NMN 确实可加速小鼠的死亡，增加死亡率。

因此，本次实验结果表明，NMN 在某些疾病尚未证明其安全性的情况下，应谨慎推广，尤其是内毒素休克的患者，应慎用甚至是禁用NMN 治疗。