响应曲面法优化超声协同复合酶法提取广金钱草多糖工艺

黄 盼, 周改莲,2*, 黄素琴, 王 倩, 谢雪婷, 王乃斌

(1.广西中医药大学药学院, 南宁 530020； 2.广西优势中成药与民族药开发工程技术中心, 南宁 530020)

广金钱草为豆科植物广金钱草Desmodiumstyracifolium(Osb.)Merr.的干燥地上部分,又名广东金钱草、落地金钱、铜钱草、马蹄香等[1],其性凉,味甘淡,归肝经、肾经和膀胱经,具有清热除湿、利尿通淋的功效,常用于治疗热淋、砂淋、石淋、小便涩痛、水肿尿少、黄疽尿赤、尿路结石等[2]，为两广地产药材,始载于《岭南采药录》一书。广金钱草的统一药用名称源于《岭南草药志》[3]。其化合物包含黄酮、生物碱、酚类、鞣质、多糖、挥发油、皂苷、有机酸等[4]。

多糖是自然界广泛存在的一类天然有机大分子物质,也是生物机体的主要能量物质[5]。研究发现多糖具有抗肿瘤[6]、抗疲劳[7-8]、抗病毒[9]、抗氧化[10-11]、降血糖[12]、免疫调节[13]等作用。常用提取多糖的方法有热水浸提法[14]和碱提法[15]。近年来微波辅助提取法[16]、酶法[17]、超声辅助提取法[18]的应用越来越多,它们的提取效果均优于热水浸提法和碱法。酶法不仅能有效破坏细胞壁,使较多的多糖溶出,而且反应条件温和,不会破坏多糖的生物活性。超声辅助提取是利用超声空化作用,增强细胞渗透效应和毛细管效应,使有效成分溶出,此法可缩短提取时间和提高提取率,避免高温对有效成分的影响。目前中外对广金钱草多糖的研究内容较少,多集中于体内外研究以及提取工艺方面[6-13]。崔健敏等[19]正交试验优化了热水浸提法提取广金钱草多糖的最佳工艺条件；程轩轩等[20]运用响应面法对酶法提取广金钱草多糖的工艺进行了研究探索；李容等[21]采用超声法提取广金钱草多糖,通过单因素试验和正交试验优化广金钱草多糖提取的最佳工艺。目前复合酶结合超声法提取多糖的研究较多[22-23],且提取效率相对很高,方法较为完善。因此，基于前任学者的基础及启迪,将超声法与复合酶法进行协同,进而提取广金钱草多糖,并对其工艺进行最佳优化；应用加权评分法,以广金钱草提取物中多糖得率和多糖含量为综合得分,根据Box-Behnken试验设计原理,采用响应面法建立二次多项式回归方程的预测模型,构建以综合得分为响应值的响应曲面和等高线图,以期为广金钱草多糖的工艺优化研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂与试剂

纤维素酶(活力3 u/mg,北京索莱宝科技有限公司)、果胶酶(活力40 u/mg,北京索莱宝科技有限公司)、木瓜蛋白酶(活力40 u/mg,北京索莱宝科技有限公司)、苯酚(20160/11,国药集团化学试剂有限公司)、浓硫酸(2019121601,成都市科隆化学品有限公司)、一水合柠檬酸(20180522,成都金山化学试剂有限公司)、磷酸二氢钠溶液(20180408,天津大茂化学试剂厂)、无水葡萄糖(99.9%,110833-201707,中国食品药品检定研究院)；95%乙醇(2019080202,成都市科隆化学品有限公司)、石油醚(2017071701,成都市科隆化学品有限公司)、正丁醇(2019102401,成都市科隆化学品有限公司)，均为分析纯。

广金钱草药材购买于南宁市太华药业股份有限公司,经广西中医药大学廖月葵副教授鉴定为广金钱草Desmodiumstyracifolium的地上干燥部分。

1.1.2 主要仪器设备

主要仪器设备有UV-1780紫外分光光度计(岛津仪器有限公司)、HWS-26电子恒温水浴锅(上海齐欣科学仪器有限公司)、SHB-B95循环水真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、KQ5200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、SQP电子分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 广金钱草多糖的提取及测定

取烘干的广金钱草放入粉碎机中进行粉碎,粉碎后过2号筛,加石油醚脱脂回流2 h,挥干,精确称取3.0 g,按照一定的料液比加入一定的去离子水,在一定的温度下超声提取一定时间,在最佳超声波条件提取结束后,加入缓冲液和1%浓度的复合酶(纤维素酶∶果胶酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1),按照一定的pH、酶解温度、酶解时间于水浴锅进行复合酶解实验,沸水浴灭酶,过滤,减压浓缩。然后加95%的乙醇溶液,醇沉提取液离心,得到多糖沉淀,用蒸馏水溶解多糖沉淀。加入一定体积正丁醇-氯仿,搅拌10 min,将离心机设置成4 000 r/min,离心15 min,弃沉淀,得到多糖溶液。

多糖含量测定采用苯酚-硫酸法。用100 mL容量瓶将多糖溶液稀释100倍,再将其稀释10倍,往2.0 mL稀释后的多糖溶液中加入配好的5%苯酚溶液1.0 mL和浓硫酸5.0 mL,进行15 min、100 ℃的水浴加热,完成后冷却。在波长490 nm测定吸光值。

1.2.2 标准曲线的绘制

准确称取10.0 mg减压干燥至恒重的葡萄糖,加水溶解定容至100 mL,摇匀,制成0.1 mg/mL的对照品溶液。分别精确吸取0.0、0.2、0.4、0.6、1.0、1.2、1.4 mL葡萄糖对照品溶液置于具塞试管中,分别用蒸馏水补至2.0 mL。依次加入5.0%苯酚溶液1.0 mL,摇匀；缓慢加浓硫酸5.0 mL,摇匀,室温静置,15 min。以蒸馏水2.0 mL同上操作加苯酚和浓硫酸显色,作为空白对照。在490 nm处测吸光度,以溶液浓度X为横坐标,吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程为y=63.529 41x+0.002 40，R2=0.999 8。

苯酚溶液的制备:取苯酚5.0 g,加水100 mL,使其完全溶解后放置于棕色试剂瓶中避光保存。

1.2.3 综合得分的计算

多糖提取率=cVN/m×100%

(1)

式(1)中：c为浓度，mg/mL；V为体积，mL；N为稀释倍数；m为取样量，mg。

多糖得率X和多糖含量Y的计算式为

X=100%×粗多糖干品质量(mg)/原料质量(mg)

(2)

Y=100%CDV/M

(3)

式中：C为根据标准曲线计算出待测液的多糖浓度，mg/mL；D为稀释倍数；V为提取液定容体积，mL；M为干燥后所得粗多糖的质量，mg。

加权评分法:把各项与该列最大值相除再乘以100为该项得分,根据多糖得率X和多糖含量Y的作用,确定两者的权重系数,对两项指标进行加权求和,通过公式Z=0.5X+0.5Y可得综合得分Z。

1.2.4 超声波提取工艺优化

准确称取3.0 g脱脂样品于三角瓶中，各6份,在超声波200 W的条件下,分别研究液料比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 mL/g)、超声时间(60、70、80、90、100 min)、超声温度(20、30、40、50、60 ℃)对广金钱草多糖综合得分的影响。

1.2.5 超声波协同复合酶法提取条件的优化

准确称取3.0 g脱脂样品于三角瓶中，各6份,在超声波提取最佳条件下,加入缓冲液和复合酶,按照一定的pH(4.5、5、5.5、6、6.5)、酶解温度(40、50、60、70、80 ℃)、酶解时间(50、55、60、65、70 min)于水浴锅进行复合酶解实验,考察pH、酶解温度、酶解时间对广金钱草多糖综合得分的影响。

1.2.6 超声波协同复合酶法响应面实验设计

采用响应面优化法设计中心组合试验, 在单因素试验的基础上, 选择对广金钱草多糖影响较大的3个因素,以液料比A、超声时间B及酶解pHC为实验因素,采用三因素三水平的Box-Behnken法进行试验,以广金钱草多糖综合得分为响应值, 进行响应面分析。响应面分析因素水平如表1所示。

表1 响应面分析因素水平Table 1 Response surface analysis factor level

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 液料比对广金钱草多糖综合得分的影响

液料比A对广金钱草多糖综合得分Z的影响如图1所示。当溶剂加入量较少时,多糖的综合得分随液料比的加大而升高。当液料比升至40∶1 mL/g时,多糖综合得分升高至最高值,达98.16。随着液料比的升高,综合得分出现下降趋势,可能随着液料比的增加,底物浓度降低进而导致多糖提取量的减少,多糖分子被溶出的同时其他杂质也被溶解,而大量杂质分子的存在会挤占多糖的溶出空间,导致广金钱草多糖的综合得分不升反而下降,因此液料比应该选择40∶1 mL/g。

图1 液料比对广金钱草多糖提取综合得分的影响Fig.1 Effect of liquid-material ratio on the comprehensive score of extraction of polysaccharides from Desmodium styracifolium

2.1.2 超声时间对广金钱草多糖综合得分的影响

超声波超声时间B对广金钱草多糖综合得分Z的影响如图2所示。在一定时间范围内,多糖综合得分随超声时间的延长而升高,当超声时间设定为90 min时,多糖综合得分升高至最高值，达100,说明此时广金钱草多糖得率和多糖含量都是最高的。超声波主要通过机械作用破坏细胞壁,促进多糖分子的溶出,而超声时间的延长,多糖综合得分也会升高,但时间过长,多糖分子的化学键积存过多的超声能量易断裂,导致多糖失活并析出,从而导致多糖得糖率和含糖量都有所下降,从而使综合得分降低。因此,选择超声时间为90 min。

图2 超声时间对广金钱草多糖综合得分的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the comprehensive score of polysaccharides from Desmodium styracifolium

2.1.3 超声温度对广金钱草多糖综合得分的影响

超声温度Tc对广金钱草多糖综合得分Z的影响如图3所示。提取温度设定为20 ℃时,多糖综合得分仅为25.52。当提取温度升高至50 ℃时,多糖的综合得分升高至最高值，达87.44。提取温度若继续升高,多糖综合得分则开始下降。多糖作为有机物质对温度变化十分敏感。在适度范围内,多糖分子的活性随温度升高而增加并加速溶出,提取率随之上升综合得分也上升。但是,多糖的分子结构在高温环境中易被破坏,导致其丧失生物活性,提取率下降且综合得分下降。因此,将提取温度选择为50 ℃。

图3 超声温度对广金钱草多糖综合得分的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the comprehensive score of polysaccharides from Desmodium styracifolium

2.1.4 酶解pH对广金钱草多糖综合得分的影响

酶解pHC对广金钱草多糖综合得分Z的影响如图4所示,在一定pH范围内,广金钱草多糖的综合得分随pH增大呈先上升后降低的趋势,pH为6时多糖的综合得分最高值达91.62,表明酶的活性存在一个最佳的pH,越接近此值,酶的活性越高,所以选择pH为6作为最佳酶解pH。

图4 酶解pH值对广金钱草多糖综合得分的影响Fig.4 Effect of pH value of enzymatic hydrolysis on the comprehensive score of polysaccharides from Desmodium styracifolium

2.1.5 酶解温度比对广金钱草多糖综合得分的影响

酶解温度Tm对广金钱草多糖综合得分Z的影响如图5所示。广金钱草多糖综合得分随温度升高有先上升后缓慢下降趋势,当酶解温度在60 ℃时,多糖的综合得分升高至最高值，达99.57。这是由于酶发挥其活性需要一个最适温度,当超过此温度后,酶结构会慢慢变性,从而使酶解程度降低,因此选择酶解温度为60 ℃。

图5 酶解温度对广金钱草多糖综合得分的影响Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the comprehensive score of polysaccharides from Desmodium styracifolium

2.1.6 酶解时间对广金钱草多糖综合得分的影响

酶解时间tm对广金钱草多糖综合得分Z的影响如图6所示。广金钱草多糖的综合得分随酶解时间延长而呈上升后下降的趋势,当酶解时间在60 min时,多糖的综合得分升高至最高值，达90.09。酶解时间若继续升高,多糖综合得分则开始下降。可能是因为细胞壁被充分分解后,活性随时间升高而增加并加速溶出,但时间过长,可能是酶对多糖分子产生了轻微的降解,导致其综合得分降低,因此酶解时间选择60 min。

图6 酶解时间对广金钱草多糖综合得分的影响Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on the comprehensive score of polysaccharides from Desmodium styracifolium

2.2 响应面法优化多糖提取工艺

2.2.1 Box-Behnken实验结果

利用Design-Expert软件中的Box-Behnken法对实验方案进行优化设计,安排并实施17个实验点,实验点方案及相应结果如表2所示。

表2 响应面法优化实验方案及相应结果Table 2 Optimization test scheme and corresponding results by response surface method

基于本次实验所得数据,以广金钱草多糖提取效果的综合得分Z,以自变量编码A(液料比)、B(超声时间)、C(酶解pH)进行回归分析,并得到以下回归方程:

Z=59.48+14.40A-10.87B-6.33C+7.33AB-16.78AC+3.67BC-2.62A2-7.58B2-0.65C2。

方差分析结果如表3所示。由表3可知,该试验的模型P<0.05,表明该模型显著,失拟相P=0.066 7>0.05,不显著,极差R2的值为86.51%>85%,说明建立的模型能较好地预测广金钱草多糖综合得分,试验结果与预测值差异较小,拟合程度较好。并且由表3中的P值可知,B、AC均为二次回归模型的显著性因素(P<0.01)。从F值看出,各因素对广金钱草多糖综合得分的影响程度依次为液料比A>超声时间B>酶解pHC。

表3 回归方差分析结果Table 3 Results of regression analysis of variance

2.2.2 响应曲面分析

根据回归方程,得到各因素对综合得分影响,做出响应曲面和等高线图，结果如图7～图9所示。分别将液料比A、超声时间B、酶解pHC其中两个因素固定在零水平,可以得到另外两个因素的交互作用对多糖综合得分的影响,通过响应面更加直观地表现出来。

图7 液料比和超声时间对综合得分的高线图和响应面图Fig.7 Height diagram and response surface diagram of comprehensive score of liquid-to-material ratio and ultrasonic time

由图7可知,等高线呈椭圆形,曲面弯曲程度较陡,A方向上曲线的坡度变化比B方向上曲线的坡度大,说明在液料比A和超声时间B的交互作用中液料比对广金钱草多图综合得分影响更大。

由图8可知,等高线呈椭圆形,A方向上曲线的坡度变化比C方向上曲线的坡度大,说明在液料比A和酶解pHC的交互作用中液料比对广金钱草多图综合得分影响更大。

图8 液料比和酶解pH对综合得分的高线图和响应面图Fig.8 Height diagram and response surface diagram of the comprehensive score of liquid-to-material ratio and enzymolysis pH value

由图9可知,曲面弯曲程度较缓,说明超声时间B和酶解pHC的交互效应对广金钱草多糖的综合得分影响并不明显。

由图7～图9的3D响应面图可知,液料比与超声时间、酶解pH相比,液料比等高线密度高于其余两个因素的等高线密度,说明液料比较超声时间、酶解pH对广金钱草多糖综合得分影响更为显著,与方差分析结果一致。

图9 超声时间和酶解pH对综合得分的高线图和响应面图Fig.9 Height diagram and response surface diagram of the comprehensive score of ultrasound time and enzymolysis pH value

2.2.3 工艺的优化组合及验证

通过回归模型预测,得到超声结合复合酶提取广金钱草多糖的最佳工艺条件为液料比1∶50 mL/g、超声时间85.23 min、酶解pH 5.5,在该条件下,多糖综合得分高达95.23,为了便于实际操作,将此工艺调整为液料比1∶50 mL/g、超声时间86.0 min、酶解pH 5.5,在此条件下进行5次平行验证实验,得到多糖综合得分均值为92.09,与预测值综合得分95.23相接近,符合度96.7%,表明该工艺稳定可靠。具体结果如表4所示。

表4 工艺优化验证结果Table 4 Verification results of process optimization

3 讨论

实验采用复合酶协同超声的方式,研究多种酶对广金钱草多糖提取的综合作用,从而不断提高提取率。响应面优化法是一种实验条件寻优的方法,本实验在单因素的基础上,利用响应面法优化广金钱草多糖提取工艺,方差分析结果表明,影响广金钱草多糖综合得分的影响从大到小的顺序为液料比A>超声时间B>酶解pHC,且在交互效应对广金钱草多糖综合得分的影响中,料液比与超声时间的交互效应对广金钱草多糖综合得分的影响最大。在1%复合酶浓度的条件下,最佳提取条件为液料比为1∶50 mL/g、超声时间为86 min、酶解pH为5.5。广金钱草多糖综合得分预测值为95.23。

经过多次实验得到的最佳优化结果,发现最佳提取条件并非是每个单因素的最佳结果,这可能是多因素综合作用的结果,可能由于液料比、超声时间与酶解pH并非都是成正比关系,所以综合结果并非和理论值相符。此外,本次实验只探究了以上3个因素与广金钱草多糖综合得分的变化关系,部分因素如超声温度、酶解时间或酶解温度也会影响实验结果。本实验以多糖得率和多糖含量结合为综合得分,结果还发现多糖得率和多糖含量并非成正比,可能与多糖的结构以及类型有关。未来还可从广金钱草多糖的构型及构效来研究广金钱草多糖的药效机制,为广金钱草的临床应用研究提供参考依据。