枫香叶采后挥发物表征及影响因子研究

高艳芳，薛彬娥，郭 微，吴 伟，劳清华，吴莉娴，李永泉，张 晖

(仲恺农业工程学院，广东 广州 510225)

植物挥发性有机化合物(PVOCs)是植物在生长发育过程中通过各种次生代谢途径合成和释放的低沸点、易挥发的小分子有机化合物的总称，包括烃类、醇类、醛类、酮类、有机酸类、内酯类、含氮化合物和有机硫类[1—2]。植物器官和组织在自然状态下会分泌和释放具有芳香气味的有机挥发性物质，这被认为是大自然长期进化选择的结果，是对环境的适应或繁衍需要[3]。这些物质通常具有抗菌、杀菌、净化空气、消除疲劳等功能[4—5]。

枫香(Liquidambar formosana)系金缕梅科(Hamamelidaceae)枫香树属(Liquidambar)落叶植物，最新分类系统将其置于蕈树科(Altingiaceae)[6]。枫香种源遍及秦岭以南温暖湿润的地区[7]，适宜性强[8]，景观优美，具良好滞尘抑菌作用，被广泛应用于园林绿化中[9]。同时，枫香全株可入药，在民间应用广泛[10]。枫香叶内含具抑菌[11—12]、水果保鲜[13—14]、抗炎[15]、抗氧化[14]、防腐[16]等作用的化合物，可进一步开发其食品保鲜、医药、化妆品市场。目前，对于枫香叶挥发性组分的研究主要集中于提取与加工工艺。对枫香采后存放过程中挥发性化合物组分变化的研究尚未见报道。为此，本研究拟采用气相色谱/质谱(GC/MS)联用技术，探究枫香叶片挥发性组分在不同发育程度、干燥时间、储存方式及萃取温度下的消长规律，为枫香叶采后处理及高值化资源利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

枫香叶取自仲恺农业工程学院白云校区，植株树势中等，正常挂果，于树冠外围中部各方位选取大小均匀、叶色一致、无伤病叶片。将叶片按照不同成熟程度分类采集，按不同方式储存备用(表1)。

表1 枫香叶采后贮藏及萃取条件Table 1 Post-harvest storage and extraction conditions of Liquidambar formosana leaves

1.2 仪器与设备

仪器：Agilent 7890A/5975C型气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)、TVOC采样管/Tenax-TA吸附管(6 mm × 150 mm)玻璃材质(安徽中析仪器设备有限公司)、数显电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.3 样品萃取与测定

1.3.1 萃取方法

称取5 g样品，剪碎置于250 mL锥形瓶内，恒温水浴加热1 h，利用针筒进行间歇抽气，抽气频率为10 min抽取3次，以提高吸附效率，将样品有机挥发物(VOCs)充分富集于Tenax-TA吸附管中，然后经2 mL正己烷慢速洗脱，洗脱液过0.22 µm滤膜以备用。每个处理3次重复。

1.3.2 仪器条件

仪器采用Agilent 7890A/5975C型气相色谱-质谱联用仪，色谱柱为HP-INNOWAX毛细管柱(30 m ×250 µm，0.25 µm)，进样口温度 160 ℃，升温程序：初始温度 50 ℃，保持 1 min，5 ℃·min-1上升至100 ℃，保持 5 min，再以 8 ℃·min-1上升至 230 ℃，保留25 min。

质谱条件：离子化方式EI，电子能量70 eV，离子源温度280 ℃，四级杆温度150 ℃，全扫描模式，质量范围 33～350 amu(m/z)，载气为氦气，流速 1 mL·min-1。

1.4 质谱图分析

由 GC-MS分析得到的质谱数据在美国国家标准与科学技术研究院(NIST08)质谱库中进行检索，结合相关文献和人工谱图解析对各个化合物进行定性，同时用面积归一化法计算各成分相对含量，确认枫香叶芳香化学组分及处理间的差异。

2 结果与分析

2.1 不同发育程度的枫香叶挥发性组分差异

枫香嫩叶和成熟叶的挥发物组分数量无显著差异。其中，嫩叶中检测到15种萜烯类化合物，以β-水芹烯、α-蒎烯、β-侧柏烯为主；成熟叶中检测到 13种萜烯类化合物，以 β-侧柏烯、松油烯、4-蒈烯为主(表2)。部分物质仅存在于嫩叶中，如莰烯、β-萜品烯、罗勒烯等；3-蒈烯及 γ-松油烯仅存在于成熟叶中；嫩叶的 α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯相对含量均高于成熟叶，而成熟叶中桧烯、β-侧柏烯、月桂烯、蒈烯、γ-松油烯等化合物相对含量高于嫩叶。

表2 不同发育程度枫香叶萜烯类组分及相对含量Table 2 Components and relative contents of terpenes in Liquidambar formosana leaves at different developmental levels

2.2 不同干燥时间对枫香挥发性组分的影响

干燥时间对枫香叶挥发性化合物的影响见表3、图1。α-蒎烯、桧烯、β-蒎烯、β-水芹烯、柠檬烯等主要挥发性成分相对稳定，在不同干燥时间的枫香叶中均被检测到。不同干燥时间分别检测出14(0 d、鲜叶)、11(1 d)、10(2 d)、10(3 d)、10(4 d)、9(5 d)、14(6 d)种挥发性成分(图1)。0 d 与 1 d、2 d、3 d、4 d、5 d样品所检测得到的化合物数量呈现出显著差异。第0、6 d均检测到14种化合物(图1)，但0 d所检测到的萜烯类化合物种类较6 d多(表3)。干燥6 d检测到的萜烯类化合物最少，仅 5种。β-萜品烯、松油烯仅在鲜叶(干燥1 d)中被检测到。

图1 不同干燥时间下枫香叶挥发性化合物数量的变化Fig. 1 Number of volatile compounds in Liquidambar formosana leaves at different drying time

图2 不同储存方式下枫香叶挥发性化合物的数量Fig. 2 Number of volatile compounds in Liquidambar formosana leaves under different storage conditions

表3 不同干燥时间下枫香叶萜烯类组分及其相对含量Table 3 Components and relative contents of terpenes in Liquidambar formosana leaves at different drying times

2.3 不同储存方式对枫香挥发性组分的影响

以不同储存方式下干燥8 d(恒重)的枫香叶样品为材料，萃取温度70 ℃，对其挥发性成分进行检测。如图2所示，-5 ℃为最佳储存方式，可保留更多挥发性化合物，共计13种，显著高于17 ℃干燥和25℃干燥条件下保留的挥发性化合物，即-5 ℃保存下挥发性有机化合物更为稳定。表4显示，侧柏烯、月桂烯仅在冷冻干燥储存下检测到，萜品油烯仅在17 ℃干燥储存方式下检测得到。α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯、柠檬烯、β-侧柏烯等主要化合物表现较为稳定，在不同储存方式下均被检测到。17 ℃干燥储存的枫香叶最多可检测到10种挥发物，且在此储存方式下 α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯、柠檬烯的相对含量较-5 ℃及25 ℃干燥储存的高。

表4 不同储存方式下枫香叶萜烯类组分及相对含量Table 4 Components and relative contents of terpenes in Liquidambar formosana leaves under different storage methods

2.4 不同萃取温度对枫香挥发性组分的影响

比较不同萃取温度条件下枫香叶挥发性组分的差异(图3)。在90 ℃下可萃取得到9种挥发性化合物，显著高于 50 ℃、25 ℃。70 ℃最多可萃取得到8种挥发性组分。25 ℃萃取效果最差，最多可得到4种挥发物。由表5可以看出，萜烯类化合物中的 β-侧柏烯仅在 90 ℃萃取条件下检测到，室温萃取后仅检测到1种萜烯类化合物(α-蒎烯)。70 ℃萃取得到的萜烯类化合物相对含量均较90 ℃高，α-蒎烯、柠檬烯相对含量较50 ℃萃取的低。在控制成本的情况下，选择70 ℃作为挥发物萃取温度，可得到更多的萜烯类化合物。

图3 不同萃取温度下枫香叶挥发性化合物数量Fig. 3 Number of volatile compounds in Liquidambar formosana leaves at different extraction temperatures

表5 不同萃取温度下枫香叶萜烯类组分及相对含量Table 5 Components and relative contents of terpenes in Liquidambar formosana leaves at different extraction temperatures

3 讨论

植物次生代谢产物的合成和积累受其生长发育的影响[17]。枫香成熟叶与嫩叶挥发性化合物数量无显著差异，但嫩叶较成熟叶含更多挥发性组分，所检测到的主要挥发性成分 α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯相对含量也较高。分析结果还表明，3-蒈烯、γ-松油烯仅存在于成熟叶中，而莰烯、β-萜品烯、罗勒烯仅存在于嫩叶中。Southwell等[18]指出，部分单萜和倍半萜的生物遗传途径在第一片子叶出现时就开始作用，如蒎烯。但并非所有的化合物的合成途径均从发育早期就已经开始，松油烯就是在个体发育后期才开始形成。不同发育程度叶片化合物的种类与含量存在差异，这可能与不同化学成分合成途径及其生物功能差异有关。

干燥是植物组织或器官长期保存的最好方法之一[19]。本研究中，α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯、柠檬烯等主要挥发性成分表现相对稳定，在不同干燥时间内均被检测到。Raina等[20]研究指出，长期贮藏对藏红花风味浓度有较大影响。龙玲等[21]也认为，随着干燥时间延长，尾叶桉木材总挥发性有机物释放速率逐渐降低。干燥时间延长使得挥发性组分减少或消失，同时又有部分挥发物合成，如酯类物质和酚类物质。干燥时间对于枫香挥发性成分影响较小，可能与本研究涉及的干燥时间阈值较小有关。

Raina等[20]提出不同干燥条件对物种化合物含量有重要影响。枫香叶冷冻干燥储存和17 ℃储存可保留更多化合物，室温保存会失去较多化合物，但 α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯、β-侧柏烯、柠檬烯等主要挥发性成分仍可被检测到。沈静等[22]认为干燥方式对香气的影响最大，Song等[23]也得出同样的结论。

萃取温度不同也导致所测的植物挥发性化合物有所差异[24—25]。枫香叶高温萃取可获得更多的挥发性化合物，在90 ℃时可检测到9种挥发性成分。室温萃取所得化合物种数虽最少，但更能反映园林应用中枫香叶芳香物质挥发的实际情况。

芳香物质的开发利用是枫香资源开发利用的重要方面，枫香叶、树脂均可提制 α-蒎烯、β-蒎烯、石竹烯、柠檬烯等多种挥发性化合物[26—27]，这些化合物是医药、化工、香料工业的重要原料。枫香释放的挥发性有机化合物包含烯类、醇类、酯类、醛类、酮类及烷烃类等 6大类挥发性有机化合物，其中以萜烯类化合物为主要芳香化合物[2]，构成了枫香的独特香气。这类次生代谢产物在提高植物保护能力、生存竞争能力以及协调植物与环境的关系方面发挥重要作用，其合成及分解与生长阶段、环境条件和气候因素有着较强的相关性和对应性[28]。由于植物挥发性有机化合物的合成与释放机制较为复杂，且枫香为彩色落叶植物，次生代谢过程更加复杂，故其影响机制需更细致的研究。

致 谢：仲恺农业工程学院园艺园林学院梁晴，化学化工学院张汉辉、东方云等人为采样与提取测定给予大力支持，谨致谢意。