基于代谢组学分析两种萎凋方式对白茶萎凋过程代谢物与品质的影响

岳文杰，洪翠云，赵 峰，宁 芊，陈凌华，叶乃兴，陈明杰

(1. 福建农林大学金山学院，福建 福州 350002；2. 福建省亚热带植物研究所 / 福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建 厦门 361006；3. 福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；4. 福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；5. 信阳师范学院生命科学学院 / 河南省茶树生物学重点实验室，河南 信阳 464000)

白茶是中国传统六大茶类之一，主产于福建省宁德市和南平市，以其外形满披白毫，汤色浅黄明亮，滋味鲜醇清甜有毫香等独特品质广受消费者喜爱[1—2]。由于白茶“不炒不揉”的制作工艺，使其很大程度上保留了茶叶中原有的营养成分，具有抗氧化、消炎解毒、预防心血管疾病、调节免疫功能、防癌抗癌、抗高血压等多种保健功效[3]，远销欧美、东南亚及港澳台地区[4—5]。

白茶加工包括萎凋和烘干两道工序，萎凋工艺是白茶品质形成的关键加工工序。鲜叶在较长时间的萎凋过程中，内含物发生复杂变化，逐渐形成白茶特有的汤色和滋味，萎凋过程中鲜叶的变化一直都是白茶加工研究的热点。室内自然萎凋和空气能萎凋是当前白茶萎凋的主要方式，室内自然萎凋为传统白茶萎凋工艺，在萎凋室通风良好的条件下，使萎凋叶成分发生缓慢变化，历时时间长，对茶多酚、儿茶素、可溶性糖和氨基酸等物质积累有促进作用[6—7]。空气能萎凋主要利用空调与除湿机人工调控室内温湿度，大幅缩短萎凋时长，促进了醇类和醛类等香气物质提升[7—9]。在白茶萎凋过程中，萎凋叶内部的分子机制类似叶片衰老机制，多数降解酶表达上调，参与抗降解保护的酶下调，同时由于萎凋叶失水，使萎凋后期酶蛋白活性降低，构成白茶颜色、滋味和香气的儿茶素、茶氨酸、γ-氨基丁酸、苯乙醇和苯乙醛等物质的生物合成受阻含量下降，而黄酮、咖啡碱、游离氨基酸、茶黄素和茶红素等物质含量提升[10—13]。

代谢组学是继基因组学、转录组学及蛋白组学之后出现的新兴组学。该技术以小分子代谢物为主要研究对象，通过高通量检测和多元数据统计分析描述这些代谢物在生物体中的代谢变化[14]。由于代谢组学具有高灵敏度、高通量的特点，其收集的信息与生物生理状态最为接近，较其他组学更能揭示基因与生物体的关系。本研究主要采用超高效液相色谱串联飞行时间质谱结合多变量分析方法，通过对比室内自然萎凋和空气能萎凋两种方式对白茶加工过程中代谢物的影响，发掘其主要差异代谢物及其动态变化规律，以期为进一步明确白茶在萎凋过程中的代谢物变化，为白茶加工技术改进提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要设备与试剂

超高效液相色谱串联飞行时间质谱仪(SYNA PT G2-Si HDMS，美国Waters公司)、高速冷冻离心机(5430R，德国 Eppendorf公司)、Vortex-Genie涡旋振荡器(G560E，美国Scientific Industries公司)、恒温超声波萃取设备(KQ-300GDV，昆山市超声仪器有限公司)。

甲醇、乙腈、甲酸(德国默克公司)、乙酸(美国天地公司)、去离子水(Milli-Q净水系统制备)，所有化学试剂均为色谱纯级。用于物质鉴定的标准品：儿茶素(Catechin，C)、表儿茶素(Epicatechin，EC)、没食子儿茶素(Gallocatechin，GC)、表没食子儿茶素(Epigallocatechin，EGC)、儿茶素没食子酸酯(Catechin gallate，CG)、表儿茶素没食子酸酯(Epicatechin3-O-gallate，ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)、表阿夫儿茶精(Epiafzelechin)、3-没食子酰基没食子儿茶素(3-Galloylgallocatechin)、原花青素B1(Procyanidin B1)、原花青素 B2(Procyanidin B2)、原花青素 B3 (Procyanidin B3)、原花青素A1(Procyanidin A1)、原花青素 A2(Procyanidin A2)、槲皮素(Kaempferol)、山奈酚(Quercetin)、柚皮素(Naringenin)、牡荆素(Vitexin)和异牡荆素(Isovitexin)、山奈酚葡萄糖甙(Kaempferol glucoside)、山奈酚-3-O-葡萄糖甙(Quercetin-3-O-glucoside)、芦丁(Rutin)、没食子酸(Gallic acid)、绿原酸(Chlorogenic acid)、咖啡酸(Caffeic acid)、可可碱(Theobromine)、反式阿魏酸(Trans-ferulic acid)、顺式对香豆酸(Cis-p-coumaric acid)、(E)-3-吲哚丙烯酸(Trans-3-indoleacrylic acid)、芥子酸(Sinapic acid)、L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)、还原型谷胱甘肽(Glutathione)、氧化型谷胱甘肽(Oxidized glutathione)等。

1.2 方法

1.2.1 样品采集

取一芽三、四叶福安大白茶树品种为试材，采取室内自然萎凋和空气能萎凋两种方式制备白茶样，分别萎凋60 h和36 h，萎凋时温度、相对湿度分别为 26.6±1.4 ℃、(88.9±3.4)%和 28.0±0.5 ℃、(87.3±5.7)%。最后均采用链板式烘干机烘干，烘干温度120 ℃，时间20 min(茶样在南平市政和瑞茗茶叶有限公司制备)。

试验样品选取萎凋过程样，即在萎凋过程中，每3 h取样一次，取样时每个样品取10个完整一芽三、四叶，以锡箔纸包裹，在液氮中保存，每个过程样取3个重复，分别标记为：F(鲜叶)、N(自然萎凋)、C(空气能萎凋)，并以数字顺序标记萎凋过程样与烘干样，样品取后冻干处理，于–80 ℃超低温冰箱保存。

1.2.2 样品检测

将各过程样研磨成粉，称取10 mg，添加200 µL 80%甲醇超声萃取，后至离心机常温离心，保存上清液；添加甲醇、超声萃取和离心操作重复2次，合并上清液；再次将样品添加 200 µL 80%甲醇和0.1%甲酸(V/V)超声萃取和离心(重复 1次)后合并 2次上清液；上清液过滤后稀释 50倍上机进样(超声条件：25 ℃，30 min；离心条件：12000 g，3 min)。

将研磨成粉的全部过程样混匀，按上述茶样上机前处理步骤制备质量控制样，标记为QC；不加入样品只添加相应等量试剂，按上述茶样上机前处理步骤制备空白样，标记为Blank。

1.2.3 设备参数设定

利用超高效液相色谱串联飞行时间质谱仪采集数据，选用Acquity UPLC HSS T3 column色谱柱(100 mm × 2.1 mm, 1.8 µm, Waters, Manchester,UK)，流动相条件：5%乙腈水溶液(标记为 A)，含0.1%甲酸的乙腈溶液(标记为 B)；线性梯度洗脱条件：0%B (起始)—7%B (2 min)—40%B (13 min)—100%B (14 min)—0%B (17 min)；其他参数设定：流速0.3 mL·min–1，进样体积1 µL，连续进样间隔4 min，分析时间20 min，毛细管电压±2.0 kV，离子源温度120 ℃，电子轰击能量10～40 eV，m/z全扫描分析(扫描范围0～1200 Da)。

1.3 数据采集与处理

1.3.1 数据采集

进样过程采用MassLynx v4.1软件操控，以正负2种离子模式 ESI(+/-)扫描，为监测仪器稳定性，质量控制样每隔10个样品注入1次；采集后原始数据导入Progenesis QI v2.1软件处理，导出含各类物质质荷比、保留时间和峰面积(Peak Area)等信息的数据矩阵表；矩阵表通过空白对照样数据清除污染，质量控制样数据计算相对标准偏差(RSD)，并以 RSD≤30标准，去除不可靠代谢物信息，并进一步校正每个样品重量(精确至1 mg)后，对3个重复取平均值。

1.3.2 数据分析与代谢物鉴定方法

采用 SIMCA-P+ v14.1软件开展主成分分析(PCA)；采用 MultiExperiment Viewer v4.9.0(MeV)软件开展层次聚类分析(HCA)和热图分析(heat-map)；采用Microsoft Office Excel v2016软件开展差异代谢物变化分析。

代谢物的鉴定以检测获得的精确分子量、保留时间和MS/MS二级碎片信息为依据，通过对比已购买的化合物标准品，HMDB、ChemSpider和Metlin等在线数据库和文献的代谢物进行物质鉴定。

2 结果与分析

2.1 两种萎凋方式对萎凋过程代谢物影响的主成分得分图分析

主成分分析(PCA)表明，在 PCA得分图上，2种萎凋处理白茶样品均随萎凋时间的变化，在正、负离子模式下分别沿主成分1坐标轴的正方向和负方向移动，表明代谢物的含量在萎凋过程中发生明显的规律性变化。但2种萎凋方式对茶鲜叶中代谢物含量变化速率的影响存在差异，空气能萎凋加快了鲜叶内含成分的变化速率，以负离子模式为例(图1: a)，在PCA得分图上，2种萎凋方式的茶样可以分为3个区域，第一个区域为自然萎凋前21 h茶样，这些茶样在得分图的空间位置上接近，表明这些代谢物的含量较接近，而空气能萎凋茶样仅萎凋3 h其在得分图的空间位置已经明显与之分离，可见空气能萎凋较自然萎凋加速了鲜叶中代谢物的变化；在第二个区域内，自然萎凋至51 h与空气能萎凋至24 h的茶样的空间位置接近，表明这些茶样中代谢物的含量相对接近；至两种萎凋处理后期，茶样中的代谢物含量又较为接近，在得分图的空间中聚为第3个区域。正离子模式下萎凋初期的变化趋势与负离子模式接近，在萎凋时间上依然沿得分图坐标轴发生有规律的变化(图1: b)。

图1 两种萎凋方式白茶主成分得分图分析Fig. 1 Principal component analysis score plot of 2 kinds of withering white tea

2.2 两种萎凋方式对萎凋过程代谢物影响的主成分载荷图分析

主成分载荷图(Loading Plot)是利用样品中各代谢物在主成分1和主成分2形成的坐标系中的位置来解释该物质对PCA模型的贡献，距离坐标中心越远的代谢物，对该模型的贡献度越大。2种萎凋方式下，贡献度大的代谢物如图2所示，在正负离子2种模式下，这些代谢物共鉴定到奎宁酸(Quinic acid)、茶没食子素(Theogallin)、EC、ECG、EGC、EGCG、咖啡碱、木麻黄素(Strictinin)、3,4-二羟基苯甲醛(3,4-Dihydroxybenzaldehyde)、2'-羟基二氢大豆素(2'-Hydroxydihydrodaidzein)、聚酯型儿茶素A(Theasinensin A)、聚酯型儿茶素 B(Theasinensin B)、Gladiatoside C1、Pratenol B等14种代谢物。

图2 2种萎凋方式白茶主成分载荷图分析Fig. 2 Loading plot of 2 kinds of withering white tea

不同差异代谢物在萎凋过程中的变化趋势如图3。咖啡碱在2种萎凋方式下的含量变化趋势趋于一致，两条趋势线几乎重叠，表明咖啡碱的含量变化受不同工艺影响小，同时，2种工艺均提升了咖啡碱的含量；2'-羟基二氢大豆素的含量在萎凋过程中呈下降趋势，但其变化规律与咖啡碱相似，萎凋方式对其影响小；2种工艺均使EGCG含量降低，空气能萎凋由于温度与湿度等因素的影响，EGCG含量下降更明显，空气能萎凋EGCG含量在同萎凋过程中均低于自然萎凋白茶；ECG在空气能萎凋初期含量略有上升，至萎凋9 h后含量呈下降趋势，而在自然萎凋过程中，其含量虽在萎凋初期下降，但至萎凋15 h后，含量呈现上升趋势，直至42 h后才出现与空气能萎凋15 h一致的下降规律，表明空气能萎凋加速了ECG的氧化速度，导致其含量下降速度提升；EGC、EC和 Gladiatoside C1等3种代谢物含量变化趋势接近，均随萎凋的进行不断下降，但空气能萎凋同样加速了其下降速度，萎凋3 h时含量明显下降，自然萎凋初期EGC的含量则不断升高，直至萎凋21 h后其含量出现下降趋势，此后含量变化规律同空气能萎凋基本一致；聚酯型儿茶素A在萎凋过程中含量呈上升趋势，但其变化规律与EGCG、EGC、EC等代谢物变化一致，空气能萎凋在初期即对其产生较大影响，而自然萎凋对其产生的影响明显延后；3,4-二羟基苯甲醛和Pratenol B等含量变化规律一致，但空气能萎凋使其含量下降更多，在萎凋过程中同时间点上其含量均低于自然萎凋；茶没食子素与奎宁酸在萎凋过程中变化规律也趋于一致，但自然萎凋对其含量的影响明显较空气能萎凋延后；木麻黄素和聚酯型儿茶素B变化趋势一致，含量在空气能萎凋初期迅速提升，随着萎凋的进行，其含量出现下降的趋势，自然萎凋则逐步提升了它们的含量，直至萎凋结束。

图3 两种萎凋方式的白茶14种主要代谢物含量变化趋势Fig. 3 The contents and trend changes of 14 major metabolites in 2 kinds of withering white tea

2.3 两种萎凋工艺对白茶品质的影响差异

为了进一步比较2种萎凋方式对白茶品质的影响，通过对比含量差异(P<0.05)筛选获得47种差异代谢物(图4)。结果表明，空气能萎凋处理有12种差异代谢物含量高于自然萎凋，如原花青素B1、B3，2种茶氨酸异构体(Theanine isomer)，CG，绿原酸，茶没食子素，奎宁酸，1-没食子酰基葡萄糖异构体3(1-Galloyl-glucose isomer 3)，1,4-二咖啡酰奎宁酸(1,4-Dicaffeoylquinic acid)，杨梅素3-洋槐葡萄糖苷(Myricetin 3-robinobioside glucoside)，(-)-表阿夫儿茶精3-没食子酸酯((-)-Epiafzelechin 3-gallate)等，其他35种差异代谢物则在自然萎凋处理下含量更高。不同类型的差异代谢物在2种萎凋处理下的含量变化具有一定规律，自然萎凋使黄酮(醇)及其糖苷物质数量更多，含量更高，这些物质在自然萎凋后期含量提升明显。由于空气能萎凋时间较自然萎凋时间更短，温度更高，可能加速这些物质氧化，使其含量更低；自然萎凋同样促进表儿茶素没食子酸酯-(4β->8)-表没食子儿茶素没食子酸酯(Epicatechin 3-O-gallate-(4β->8)-epigallocatechin 3-O-gallate ，ECG-(4β->8)-EGCG)、表儿茶素-没食子儿茶素(Epicatechin-(4β->8)-gallocatechin，EC-GC)、表没食子儿茶素-(4β->8)-儿茶素(Epicatechin 3-O-gallate-(4β->8)-catechin，ECG-(4β->8)-C)、聚酯型儿茶素F(Theasinensin F)等儿茶素聚合体含量提升，特别是萎凋至51 h后含量提升明显，萎凋时长可能是导致其含量高于空气能萎凋的重要因素。而茶没食子素、奎宁酸、绿原酸等3种酚酸物质在空气能萎凋下含量更高，分别达到自然萎凋处理的1.78、1.60和1.84倍，这些物质在自然萎凋后期，特别是萎凋至57 h后含量大幅下降，空气能萎凋由于萎凋时间相对较短，使其保留更多；而没食子酸与对羟基扁桃酸等酚酸物质在自然萎凋白茶中含量更高，含量变化趋势相近，虽然空气能萎凋温度更高，但自然萎凋时间更长，时间较温度对其影响更明显；此外，2种茶氨酸异构体在空气能萎凋下含量更高，分别为自然萎凋的2.2与2.18倍，但在2种萎凋过程中呈现相似的下降趋势，受到萎凋时长的影响，使其在自然萎凋下含量下降更显著。

图4 两种萎凋方式的白茶主要差异代谢物含量变化热图Fig. 4 Heat-map of the contents of major differential metabolites in 2 kinds of withering white tea

3 讨论

3.1 自然萎凋与空气能萎凋对萎凋过程代谢物变化影响

自然萎凋和空气能萎凋使白茶代谢物含量在萎凋过程中发生规律性变化，但两种萎凋方式的环境温湿度、萎凋时间不同，对代谢物含量变化速率的影响存在差异。空气能萎凋加快白茶萎凋过程中代谢物的转化速率，而至萎凋后期及烘干阶段，代谢物含量又逐渐与自然萎凋趋于一致。两种萎凋方式对各类代谢物含量的影响体现3种规律：第一，不同萎凋方式对部分代谢物影响较小，如咖啡碱、EGC和2'-羟基二氢大豆素等化合物在2种萎凋方式下的含量变化趋势非常相似；第二，空气能萎凋加快部分代谢物的转化速率，但对其最终含量影响较小，如 EGCG、ECG、EGC、聚酯型儿茶素 A、聚酯型儿茶素B、3,4-二羟基苯甲醛、木麻黄素等；第三，不同萎凋方式对代谢物最终含量产生较大影响，如茶没食子素与奎宁酸等在自然萎凋下的含量下降更大，表明这类物质受萎凋时长的影响更大。

3.2 自然萎凋与空气能萎凋对白茶滋味品质影响

自然萎凋下多数黄酮(醇)糖苷类、ECG-(4β->8)-EGCG、ECG-(4β->8)-C、EC-(4β->8)-GC、聚酯型儿茶素F等儿茶素聚合体化合物含量更高，这些物质含量多在萎凋中后期升高；空气能萎凋下茶氨酸、茶没食子素、奎宁酸、绿原酸等物质含量更高，由于空气能萎凋时间短，这些物质保留更多。萎凋时长是导致代谢物含量差异的重要因素。在乌龙茶加工过程中，高温处理使糖苷物质含量下降[15—16]。在白茶萎凋过程中，空气能萎凋温度较自然萎凋更高，故自然萎凋的白茶糖苷物质含量提升，空气能萎凋白茶糖苷物质含量更低。两种萎凋方式均促进白茶鲜叶中单体儿茶素类物质的氧化，降低其含量，同时使部分儿茶素聚合体物质含量提升，这有利于降低茶汤的苦涩程度，增加茶叶的保健功效[17]。同时，自然萎凋下多种黄酮(醇)糖苷物质含量提升，改善了白茶口感与滋味，由于糖苷物质具有较强的抗氧化活性，白茶对心血管系统具有潜在的益处[18]。空气能萎凋处理促进茶氨酸、8-C-抗坏血酸基-EGCG和多种酚酸物质含量提升。茶氨酸具有焦糖香味和类似味精的鲜爽味，能缓解茶的苦涩味，增强甜味[19]；8-C-抗坏血酸基-EGCG对艾滋病治疗有作用[20—21]；而酚酸物质作为合成酯型儿茶素的前体，伴随酯型儿茶素的水解产生，其中咖啡酸、绿原酸在低浓度下可以与EGCG产生苦味协同和涩味抑制作用，没食子酸则与EGCG形成苦味和涩味共同协同的作用[22]。茶没食子素对茶叶鲜爽滋味也有较大贡献[22]，这些酚酸物质还具有消炎、抗病毒、抗氧化和抗癌等多种保健功能[23—27]。

总之，在白茶萎凋过程中，两种萎凋工艺处理的白茶存在共同特点：总体上可以分为萎凋前期，萎凋中期和萎凋后期等3个阶段，多种类型的代谢物含量变化存在一定规律。但由于空气能萎凋时间短，温度高而湿度低，加快了儿茶素、黄酮(醇)糖苷和酚酸、咖啡碱、茶氨酸和香豆素等多类物质含量升高或降低的速率，也使儿茶素聚合体、黄酮(醇)糖苷等多类物质在萎凋过程中含量上升比例更低。这些具有规律变化的代谢物对于形成白茶滋味风味起到重要作用，为白茶加工过程中萎凋时间与品质关系的研究提供理论依据，对白茶生产实践具有指导意义。