circNCX1通过miR-103-3p调节阿霉素诱导的心肌细胞凋亡*

法鸿鸽， 李萌阳， 常文光， 肖丹丹， 王建勋△

（青岛大学 1基础医学院，2转化医学研究院，山东青岛266021）

临床上，阿霉素（adriamycin；又称多柔比星，doxorubicin，DOX）作为一种高效的抗肿瘤药物，被广泛用于各种肿瘤的治疗，例如乳腺癌，肺癌和卵巢癌等[1]。DOX 所引起的严重的心脏毒性备受关注，可表现为不可逆的扩张型心肌病和随之而来的充血性心力衰竭，这会影响肿瘤患者长期的、整体的抗肿瘤治疗结果，也使得DOX 的临床应用受到限制[2]。因此，进一步探究DOX 诱导心肌毒性的分子机制，寻找新的治疗或干预靶点将为DOX 的临床应用提供理论依据。心肌细胞是终末分化细胞，成熟后分裂和再生能力有限，现有研究表明，心肌细胞凋亡是细胞水平DOX 诱导心肌毒性的主要原因[3-4]，但其分子机制尚未完全阐明。

非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）已被广泛报道参与了细胞增殖、凋亡、分化和代谢等多种生物学过程，进而在细胞生理和病理过程中发挥调节作用[5]。许多研究报道了非编码RNA 参与心肌细胞凋亡的调控[6-9]。环状RNA（circular RNA，circRNA）是近年来发现的一类具有特殊结构的非编码RNA，它是由外显子和/或内含子反向拼接形成的闭合环形RNA，没有5"端帽或3"端poly-A 尾巴[10]。在功能上，环状RNA 除了能与各种蛋白相互作用外，也具有竞争性结合微小RNA（microRNA，miRNA，miR）的特性，从而抑制了miRNA 对其靶基因的作用[11-12]。此外，一小部分环状RNA 仍具备翻译蛋白的能力[13]。近年来，一些研究表明circRNA 与心血管的发育和疾病密切相关，例如circASXL1、circCAMSAP1 和circHIPK3 的表达水平升高与胎儿心脏发育有关，circHRCR 的下调诱导心脏肥大，circMFACR 的上调可诱发心肌细胞凋亡和心肌梗死[14-16]。此外，circ-Pan3 和circITCH 也在近期被证明参与调控DOX 诱导的心肌毒性[17-18]。尽管关于环状RNA 的研究仍处于早期阶段，但由于其稳定的表达和组织特异性适合用作治疗靶点和诊断标记物从而引起了人们的关注。环状RNA 在DOX 诱导的心肌毒性中的作用也值得进一步探究。

我们课题组前期的研究发现，在心脏中高表达的环状RNA NCX1（circNCX1）在缺血性心肌损伤过程中以及氧化应激诱导的心肌细胞凋亡中发挥重要作用[19]。circNCX1 由细胞凋亡应激诱导，并通过靶向miR-133a-3p促进凋亡，而沉默circNCX1在体内和体外实验中均能改善心功能并抑制心肌细胞凋亡[19]。但是其在DOX 诱导的心肌毒性中是否有变化还未见报道，本研究旨在探讨circNCX1 在DOX 诱导的心肌毒性中的作用，以及其下游的作用靶点。

材料和方法

1 实验动物及分组

8 周龄的C57BL/6J 雄性小鼠[许可证号：SCXK（鲁）2019-0003]被随机分为2组：实验组小鼠注射剂量为10 mg/kg 的DOX，每周2 次，共1 周（累计剂量为20 mg/kg）；对照组小鼠注射相应剂量的生理盐水。最后一次注射后1 周取小鼠心脏组织进行相关分析。所有动物实验均得到青岛大学医学部动物护理委员会和使用委员会的批准。

2 细胞、主要试剂和仪器

心肌H9c2 细胞购自上海生命科学研究院。DMEM 培养基购自Gibco；胎牛血清购自上海依科赛生物技术有限公司；DOX 购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；miR-103 mimic 购自上海吉玛制药技术有限公司；转染试剂Lipofectamine 3000 购自Invitrogen；Trizol 试剂购自Sigma；逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR 试剂购自南京诺唯赞；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒购自上海翊圣；caspase-3/-7 活性检测试剂盒购自大连美仑；台盼蓝染料购自北京索莱宝；链霉亲和素磁珠购自无锡百迈格；生物素探针由华大基因根据设计合成；所用引物由上海生工和北京擎科生物公司根据设计合成。倒置荧光显微镜购自Olympus；实时荧光定量PCR仪购自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1 细胞的培养和处理 H9c2 细胞在DMEM 培养基中培养，培养基中添加10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L 链霉素。细胞放置于37℃、含5%CO2的恒温培养箱中培养。根据细胞的生长状态，当细胞融合度达到80%～90%时进行传代。使用2 μmol/L或者0.2 μmol/L的DOX对细胞进行处理。

3.2 细胞转染 如先前研究[19]所述合成了以pcDNA3.1 为载体的circNCX1 过表达质粒，以及shcircNCX1（序列为5"-AATAGTGTTGGAACAATTGGA-3"），阴性对照序列为5"-ACTACCGTTGTTATAGGTG-3"。miR-103-3p mimic 序 列 为5"-AGCAGCAU UGUACAGGGCUAUGA-3"，阴性对照序列为5"-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3"。依据试剂的说明，使 用Lipofectamine 3000 进 行质 粒、sh-circNCX1 和miR-103-3p mimic的转染。

3.3 RT-qPCR 使用Trizol 试剂提取组织和细胞的总RNA，然后根据说明使用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，miR-103-3p茎环法反转录的引物为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCATAG-3′。将cDNA 在CFX96 实时荧光定量PCR 系 统 进 行 检 测，使 用2-ΔΔCt公 式 计 算 数 据。circNCX1 的表达量以GAPDH 为内参照，miR-103-3p的表达量以U6为内参照，相应的引物序列见表1。

3.4 RNA 成环验证 将细胞中的RNA 逆转录成cDNA，同时提取细胞的gDNA。分别用正向引物和反向引物将两组样本进行普通PCR，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。对向引物序列为F：5′-GACTGTGTCCAACCTGACCTTGATG-3′，R：5′-CACCTCCATGATGCCAATGCTCTC-3′；反向引物序列为F：5′-GAGAGCATTGGCATCATGGAGGTG-3′，R：5′-CATCAAGGTCAGGTTGGACACAGTC-3′。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The primer sequences for RT-qPCR

3.5 TUNEL 染色 细胞接种在1 cm×1 cm 的玻片上并置于24 孔板中，经过相应处理后的细胞经PBS清洗3 遍，然后加4%多聚甲醛固定。根据制造商的说明，使用TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒进行染色，然后将细胞放置于含DAPI 染液的介质固定。置于荧光显微镜下观察凋亡细胞。通过计算TUNEL 阳性细胞核数量占DAPI 染色核数量的比例，计算凋亡细胞数的百分比。

3.6 Caspase-3/-7 活性的检测 收集处理后的细胞，然后根据说明，使用caspase-3/-7活性检测试剂盒对样本进行caspase-3/-7活性的测定。

3.7 台盼蓝染色 收集处理后的贴壁细胞，然后根据说明，使用台盼蓝染料染色。使用细胞计数板于显微镜下进行计数，计算一个视野中台盼蓝染色阳性的细胞数占细胞总数的百分比。

3.8 RNA pull-down 实验 用1%无RNA 酶的BSA和0.5 g/L酵母tRNA预处理链霉亲和素磁珠，4℃翻转3 h。分别将circNCX1 的生物素探针5"-bio-GAGACTTCCAATTGTTCCAACACTATTTCATCATTC-3" 和对照探针5"-bio-TGATGTCTAGCGCTTGGGCTTTG-3"与磁珠混合孵育，4℃翻转3 h。细胞经PBS 清洗后，用制备的冰浴裂解液[20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），200 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，6×104U/L RNA 酶抑制剂，1 mmol/L DTT，蛋白酶抑制剂]750 μL 将细胞刮下来，4℃翻转裂解3 h，然后1 000×g、4℃离心5 min。取上清中的50 μL作为input，剩余的上清分成两管，然后4℃翻转3 h 使裂解物和探针-磁珠复合物结合。使用冰浴的高盐缓冲液[0.1%SDS，1% TritionX-100，2 mmol/L EDTA，20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），500 mmol/L NaCl]洗涤3次，低盐缓冲液（0.1% SDS，1% Trition X-100，2 mmol/L EDTA，20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），150 mmol/L NaCl]洗涤1 次。然后用Trizol 提取磁珠与RNA 的复合物，通过RT-qPCR检测miR-103-3p的表达量。

4 统计学处理

实验数据通过GraphPad Prism 软件进行分析，数据以均数±标准差（mean±SD）表示。两组间数据运用t检验进行比较；多组均数间的比较运用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间的两两比较运用Tukey"s 事后检验进行比较。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 DOX能够诱导circNCX1的表达上调

首先，分别使用circNCX1 的对向引物和反向引物对H9c2 细胞的cDNA 和gDNA 进行扩增，琼脂糖凝胶电泳的条带显示对向引物能够同时扩增cDNA和gDNA，而反向引物只能扩增cDNA，表明circNCX1是反向拼接形成的环状结构（图1A）。为检测circNCX1 表达 量 的 变 化，使 用2 μmol/LDOX 处 理H9c2 细胞相应的时间（0、3、6、12 和24 h），RT-qPCR结果显示，circNCX1在DOX诱导的H9c2细胞中呈时间依赖性上升（P＜0.05），见图1B。此外，相比于对照组，注射DOX 的小鼠心肌组织中circNCX1 的表达量明显升高（P＜0.05），见图1C。因此，在DOX 诱导的心肌细胞和心脏组织中circNCX1表达上调。

2 沉默circNCX1 可降低DOX 诱导的心肌细胞凋亡率

之前研究表明，circNCX1 在心肌氧化应激过程中发挥促进心肌细胞凋亡的作用。因此，我们推测在DOX 作用心肌的过程中，circNCX1可能发挥相似的作用。为证明这一推测，我们首先使用特异性靶向circNCX1 连接区域的shRNA（sh-circNCX1）来沉默circNCX1在H9c2细胞中的表达（图2A）。接下来，使用2 μmol/L 的DOX 诱导已经转染过sh-circNCX1的H9c2 细胞24 h。TUNEL 染色的结果表明，沉默circNCX1能够明显减少DOX 诱导的心肌细胞凋亡（图2C）。此外，凋亡关键蛋白caspase-3/-7 活性的检测结果同样显示，沉默circNCX1显著抑制了DOX 引起的caspase-3/-7 活性增强（图2D）。相反的，使用低DOX（0.2 μmol/L）诱导已经转染过circNCX1 过表达质粒的H9c2 细胞24 h。台盼蓝染色显示，过表达circNCX1（图2B）进一步增加了低浓度DOX 处理下的细胞死亡率（图2E）。以上结果显示，circNCX1促进了DOX 诱导的心肌细胞凋亡，而沉默circNCX1可以有效抑制心肌细胞凋亡。

Figure 1. circNCX1 was up-regulated in DOX-treated H9c2 cells and mouse hearts. A：circNCX1 was a back-splicing formed loop in structure；B：the circNCX1 levels in H9c2 cells under 2 μmol/L DOX treatment with indicated times；C：the circNCX1 levels was increased in DOX-treated mouse heart tissues. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs 0 h group；#P＜0.05 vs control group.图1 DOX诱导circNCX1的表达上调

3 circNCX1与miR-103-3p相互作用

据报道，由外显子形成的circRNA 可以充当miRNA 的海绵，以抑制其在细胞质中的活性[20]。在先前的一篇报道中，作者通过miRNA 微阵列分析筛选了可能与circNCX1 结合的752 个miRNA[21]。在此基础上，我们运用了生物信息学软件，预测出了circNCX1 与miR-103-3p 的3 个不同的结合位点（图3A），表明circNCX1 与miR-103-3p 之间可能存在直接的相互作用。为了验证这一预测，我们进行了RNA pull-down 实验，观察到与阴性对照相比，circNCX1 的生物素探针能够富集更多的miR-103-3p（图3B）。此外，我们过表达circNCX1，检测到miR-103-3p 的表达量下调，而沉默circNCX1 则促进了miR-103-3p 的表达（图3C、D）。以上实验说明，circNCX1 能够直接结合miR-103-3p，并且抑制其表达。

4 miR-103-3p过表达可抑制心肌细胞凋亡

DOX诱导的小鼠的心脏组织中miR-103-3p的表达下调（图4A）。我们同样使用2 μmol/LDOX 处理H9c2 相应的时间，RT-qPCR 结果显示，miR-103-3p的表达随时间延长而梯度下降（图4B），因此，我们推测miR-103-3p 在DOX 作用心肌过程中发挥保护作用。在有效的过表达miR-103-3p 的基础上（图4C），我们分别检测了caspase-3/-7 的活性和细胞死亡数（台盼蓝染色）。结果显示，在DOX 诱导下，过表达miR-103-3p 能显著抑制caspase-3/-7 的活性，并且减少细胞死亡（图4D、E）。此外，在使用低浓度DOX（0.2 μmol/L）诱导H9c2 时，共转染circNCX1 过表达质粒和miR-103-3p mimic 组心肌细胞凋亡率明显较过表达circNCX1 组细胞凋亡率减少（图4F）。这些结果说明，miR-103-3p 具有抗DOX 诱导的心肌细胞凋亡的作用，且作用与circNCX1的交互作用有关。

讨论

随着RNA 测序技术的发展，环状RNA 得到广泛鉴定，此外，大量研究证实了环状RNA 的基因调控功能[22-23]。迄今为止，已报道了环状RNA 参与心血管发育和疾病。这些circRNA 中的某些在心脏病（包括心力衰竭，心脏梗塞和心脏肥大等）中表现出异常的表达和调节活性，这些发现为指导疾病治疗和诊断提供新策略[11，24-26]。作为环状RNA 最主要的功能之一，其可以充当miRNA 海绵，与miRNA 目标位点竞争结合，以抑制miRNA 活性并参与miRNA 介导的转录后调控。例如最先报道这一功能的circRNA CDR1as/ciRS-7，它具有63 个保守的miR-7 结合位点，能通过结合miR-7调节大脑发育[12，22]。

Figure 2. Knock-down of circNCX1 attenuated DOX-induced apoptosis of the H9c2 cells. The expression level of circNCX1 in the H9c2 cells transfected with sh_circNCX1 vector（A）and the circNCX1 expression vector（B）were detected；C：apoptosis was tested by the TUNEL assay（green：TUNEL-positive nuclei；blue：DAPI-stained nuclei；scale bar=20 μm）；D：the activity of caspase-3/-7 was tested；E：the percentage of cell death was quantitatively analyzed. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group；▲P＜0.05 vs scrambled control group；△P＜0.05 vs empty vector group；#P＜0.05 vs DOX group.图2 敲减circNCX1表达抑制DOX诱导的心肌细胞凋亡

Figure 3. circNCX1 interacted with miR-103-3p. A：putative binding sites of circNCX1 and miR-103-3p；B：the relevant enrichment of pulled-down miR-103-3p levels by circNCX1 probe or control probe. The expression levels of miR-103-3p with transfection of the circNCX1 expression vector（C）and the sh_circNCX1 vector（D）were detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs biotin-random group；△P＜0.05 vs empty vector group；#P＜0.05 vs scrambled control group.图3 circNCX1与miR-103-3p相互作用的验证

circNCX1是从Ncx1基因的第2个外显子转录的环状RNA，它在心脏中大量表达，并在心肌病中显示出显著的差异表达水平。RT-qPCR 检测发现，circNCX1 在DOX 诱导的H9c2 细胞和小鼠心肌组织中表达上升，提示circNCX1 可能参与调控DOX 诱导的心肌毒性。接下来的功能实验显示，沉默circNCX1可以减少DOX 诱导的H9c2 细胞凋亡。相反，过表达circNCX1 增加了DOX 诱导的心肌细胞死亡数。这些结果说明circNCX1 促进DOX 诱导的心肌细胞凋亡。生物信息学预测了circNCX1 与miR-103-3p 存在结合3 个位点。RNA pull-down 实验证明了circNCX1 能够明显的富集H9c2 细胞中的miR-103-3p。

已有多篇文献报道了miR-103-3p对细胞凋亡具有重要作用。脂多糖诱导PC12 细胞损伤模拟脊髓损伤的病理过程中，miR-103-3p 过表达显著提高了细胞活力，减少了细胞凋亡和自噬[27]。在阿尔茨海默病中，circ_0000950 通过对miR-103-3p 的海绵作用，抑制了miR-103-3p的表达，进而促进了神经元细胞凋亡[28]。此外，miR-103-3p 可以减轻肝脏损伤，包括组织损伤和线粒体损伤，抑制炎症因子的分泌，并减少了肝细胞的凋亡[29]。在心血管系统中，miR-103-3p 也参与了心脏疾病的调节。在氧化应激的人脐静脉内皮细胞中，过表达miR-103-3p 通过介导BNIP3 的下调抑制活性氧簇的产生，起到细胞保护作用[30]。miR-103-3p 可以通过抑制压力超负荷大鼠心脏中的TRPV3 信号传导来降低心肌细胞自噬活性，从而部分减轻心肌肥大[31]。然而，在心肌坏死的机制研究中，miR-103-3p 可以通过靶向FADD 促进H9c2细胞的RIPK1和RIPK3依赖性坏死[32]。在本研究中，我们证明了在DOX 诱导的H9c2 细胞中，miR-103-3p 的表达量呈时间依赖性下降，而过表达miR-103-3p 能够抑制DOX 诱导的H9c2 细胞凋亡，并且miR-103-3p是作为circNCX1的下游发挥功能的。然而，在DOX诱导的心肌损伤中，miR-103-3p的下游靶标仍不清楚，其具体的作用机制将是我们下一步研究的方向。此外，miR-103-3p 在心肌细胞中所表现出的保护作用和促进细胞死亡的作用仍没有一致的结论，这可能是因为miR-103-3p 参与了不同信号通路的调节，因此值得我们进一步探索。

综上所述，本研究表明circNCX1 在DOX 诱导的H9c2 细胞和小鼠的心肌组织中表达明显上调。沉默circNCX1可通过调节与其直接结合的miR-103-3p发挥抗心肌细胞凋亡的作用。

Figure 4. circNCX1 increased the apoptosis of H9c2 cells by inhibiting miR-103-3p. A：the miR-103-3p level was decreased in DOX-treated mouse heart tissues（n=5）；B：the miR-103-3p level in the H9c2 cells under 2 μmol/L DOX treatment for indicated time（n=3）；C：the expression level of miR-103-3p in H9c2 cells with transfection of miR-103-3p mimic（n=3）；D：the activity of caspase-3/-7 was tested（n=3）；E，F：the percentage of cell death was quantitative analyzed（n=3）.Mean±SD. *P＜0.05 vs control group；▲P＜0.05 vs 0 h group；#P＜0.05 vs negative control group；@P＜0.05 vs DOX（2 μmol/L）+negative control group；^P＜0.05 vs DOX（0.2 μmol/L）group；&P＜0.05 vs DOX（0.2 μmol/L）+negative control+circNCX1 group.图4 circNCX1靶向miR-103-3p，进而调控心肌细胞凋亡