QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法检测氟吡菌胺及其代谢物和霜霉威在叶用莴苣中的残留及消解动态

唐红霞, 黄佳庆, 孙 强, 温广月, 董茂锋*,, 王伟民*,

(1. 上海市农业科学院 农产品质量标准与检测技术研究所 农药安全评价研究中心，上海 201106；2. 上海科立特农产品检测技术服务有限公司，上海 201106)

叶用莴苣Lactuca sativa L. var. ramosa Hort.在种植过程中，极易感染霜霉病、软腐病、菌核病等多种病害[1]。687.5 g/L 氟菌 · 霜霉威悬浮剂由德国拜耳作物科学公司研发，对霜霉病、疫病、晚疫病和猝倒病等常见卵菌纲病害具有良好的防治效果[2-3]，常用于防治莴苣病害。中国《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[4]中，关于氟吡菌胺和霜霉威盐酸盐 (图式1) 的残留定义描述分别为氟吡菌胺和霜霉威，但在JMPR 报告[5]中，氟吡菌胺的膳食风险评估定义分别评估氟吡菌胺及其代谢物2,6-二氯苯甲酰胺。关于氟吡菌胺在叶菜类蔬菜中的最大残留限量 (MRLs) 中国规定为30 mg/kg[4]，国际食品法典委员会 (CAC) 规定为30 mg/kg[6]，美国规定为25 mg/kg[7]。关于霜霉威在叶菜类蔬菜中的MRL 值，CAC 规定为100 mg/kg[6]，美国规定为150 mg/kg[7]，而中国目前尚未制定其在叶用莴苣中的MRL 值。

关于氟吡菌胺残留的检测方法有气相色谱(GC)和气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS），涉及黄瓜[8]、番茄[2-3]、葡萄[9]等作物；关于霜霉威残留的检测方法主要有液相色谱 (LC)、液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS)和GC-MS/MS，涉及人参[10]、番茄[2-3,11]、马铃薯[12-13]和黄瓜[8]等作物。已有学者开展了氟吡菌胺 · 霜霉威在番茄上的残留行为研究，但尚未见其在叶用莴苣中残留消解评价和膳食风险评估的研究。鉴于此，本研究通过改良的QuEChERS 方法，采用高效液相色谱-串联质谱法测定叶用莴苣中霜霉威、氟吡菌胺及其代谢物(2,6-二氯苯甲酰胺) 残留量，并通过田间试验分析了其消解动态，旨在为制定其在叶用莴苣中的MRL 值和安全使用方法提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

高效液相色谱-串联质谱仪 (LC-8040 电喷雾离子源，日本Shimadzu 公司)；MX-F 涡动混合器 (中国Dragonlab 公司)；5415D 离心机 (Eppendorf 公司)。

氟吡菌胺 (fluopicolide，纯度93.31%)、2,6-二氯苯甲酰胺 (2,6-dichlorobenzamide，纯度99.43%)和霜霉威 (propamocarb，1 000 mg/L，溶剂为丙酮) 标准品，均为北京振翔科技有限公司产品；687.5 g/L 氟菌 · 霜霉威悬浮剂 (SC，含氟吡菌胺62.5 g/L，霜霉威盐酸盐625 g/L)，拜耳作物科学(中国) 有限公司。

乙腈和甲醇 (色谱纯)，美国Merck 公司；甲酸和乙酸铵 (色谱纯)，上海安谱实验科技股份有限公司；氯化钠 (分析纯)，上海化学试剂公司。

十八烷基键合硅胶 (C18)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA) 和石墨化碳黑 (GCB)，日本Shimadzu 公司)；多壁碳纳米管 (MWCNTs)，南京先丰纳米材料科技有限公司。

1.2 田间试验

按照《农作物中农药残留试验准则》[14]要求，于2019 年分别在上海市松江区和奉贤区温室内开展田间试验。供试药剂为687.5 g/L 氟菌 · 霜霉威悬浮剂，施药剂量为有效成分928.13 g/hm2，施药间隔期为7 d，喷雾施药3 次，每小区100 m2，同时设空白对照。分别于末次施药后2 h 及1、3、5、7、10 d 采样。随机采集两个独立的叶用莴苣样本，每个样本不少于12 株。剪取土表以上的整个个体，去除腐坏和萎蔫部分茎叶，留样至少1 kg。

1.3 检测条件

色谱条件：Shimadzu InertSustainSwift C18色谱柱 (2.1 mm × 50 mm，3 μm)；流速0.50 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL。流动相A 相为甲醇，B 相为5 mmol/L 醋酸铵 (含0.1%甲酸水溶液)，梯度洗脱程序：0～1 min (10% A)；＞1～2.5 min(10% A～90% A)；＞2.5～4.5 min (90% A)；＞4.5～5.0 min (90% A～10% A)；＞5.0～6.0 min (10% A)。

质谱条件：电喷雾离子源正离子扫描 (ESI+)；多反应监测 (MRM) 模式；离子源接口电压3.5 kV；脱除溶剂管 (DL 管) 温度250 ℃；加热块温度400 ℃；雾化气流速3.0 L/min (N2，纯度99.999%)；干燥气流速15 L/min (N2，纯度99.999%)。质谱参数见表1。

表1 霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺质谱条件参数Table1 Mass spectrometry parameters for propamocarb, fluopicolide and 2,6-dichlorobenzamide

1.4 样品前处理

样品用食品粉碎机碎粉，匀浆，称取5.0 g 于50 mL 聚乙烯离心管中，加入20 mL 乙腈，涡旋提取10 min，加入4 g 氯化钠，再次涡旋30 s，于4 000 r/min 下离心5 min；取上清液1 mL 至盛有7.5 mg 多壁碳纳米管的2 mL 离心管中，涡旋1.5 min 后，于10 000 r/min 下离心2 min；取上清液，过0.22 μm 有机微孔滤膜，待测定。

1.5 方法验证

按照《农作物中农药残留试验准则》[14]和欧盟SANTE/11 813/2017[15]准则要求，通过标准曲线、添加回收试验开展残留分析方法验证。

1.5.1 标准溶液配制及标准曲线绘制 分别准确称取一定量的氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺标准品，用乙腈溶解，配制成1 000 mg/L 标准储备溶液，于 -18 ℃保存。

分别取1 000 mg/L 氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺储备溶液和1 000 mg/L 霜霉威标准溶液，用乙腈稀释，配制成10 mg/L 的混合标准工作溶液，再用叶用莴苣空白基质溶液稀释，配制成0.005、0.05、0.1、0.5、1 mg/L 的系列基质匹配标准溶液，按1.3 节条件测定，以化合物的质量浓度为横坐标、对应的离子峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.5.2 基质效应 对于串联质谱，由于干扰或共同洗脱的基质部分影响电喷雾接口的离子化效率，从而引起离子抑制或离子增强导致出现假阴性或假阳性或不精确的定量，因此基质效应是串联质谱分析方法验证的重要参数[16-17]。分别用乙腈和空白基质配制标准溶液 (0.1 mg/L)，按照公式(1) 计算基质效应 (Me)。当Me小于20%时，认为可以忽略基质效应；反之，则说明存在明显的基质增强或减弱效应[17]。

式中，Am表示基质溶液中化合物的峰面积，As表示溶剂中化合物的峰面积，Me表示化合物基质效应。

1.5.3 添加回收试验 向空白叶用莴苣样品中分别添加0.02、0.2、2 和100 mg/kg 4 个水平的霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺标准溶液，每个水平重复5 次。添加混匀静置30 min 后，按1.3节条件测定，计算添加回收率及相对标准偏差。若上机浓度超过线性范围，则用空白基质稀释。

2 结果与讨论

2.1 方法前处理优化

2.1.1 提取溶剂优化 分别比较了添加不同量的甲酸或氨水的乙腈溶液和纯乙腈作为提取溶剂时对霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺提取效率的影响。分别用10 mL 的0.1%甲酸-乙腈、0.2%甲酸-乙腈、乙腈、0.1%氨水-乙腈和0.2%氨水-乙腈提取目标化合物。结果显示 (图1)，在0.1 mg/kg添加水平 (n = 3) 下，虽然5 种溶剂回收率均在71%～108%之间，但以0.1%甲酸-乙腈或0.2%氨水-乙腈作为提取溶剂时，霜霉威的平均回收率最高，在83%～84%之间，结合流动相中含有甲酸，最终选择以10 mL 的0.1% 甲酸-乙腈作为提取溶液。

2.1.2 吸附材料筛选 取0.1 mg/L 基质匹配混合溶液 (n = 3)，分别用50 mg C18、50 mg PSA、50 mg GCB 和5 mg 的MWCNTs 进行分散固相萃取净化。结果 (图2A) 显示，除当使用GCB 时氟吡菌胺的回收率偏低 (75%) 外，其余3 种材料的回收在89%～118%之间，均符合《农作物中农药残留试验准则》要求[14]。在分析蔬菜样品中的农药残留时，色素是最常见的杂质，通过外观鉴别不同净化剂对色素的净化效果 (图2C) 发现，使用MWCNTs 处理后的样本颜色最浅，色素净化效果最好。在此基础上进一步考察其用量对净化效果的影响发现，当MWCNTs 添加量分别为2.5、5、7.5 和15 mg 时，氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺和霜霉威的回收率在86%～103%之间，相对标准偏差 (RSD) 在1%～8%之间 (图2B)，均符合农药残留分析的要求[14]。但当其用量增加到7.5 mg 后，净化后样品的外观不再发生明显变化 (图2D)。综合考虑，最终选用7.5 mg MWCNTs 为主要吸附材料以及200 mg 无水硫酸镁作为分散固相萃取净化材料。

2.2 方法验证结果

在0.005～1 mg/L 范围内，霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺的质量浓度与对应的响应值间呈良好线性关系，R2在0.999～1.000 之间 (表2)，其基质效应分别为4.3%、21%和64%，需要采用基质匹配标准溶液进行校正定量分析。

通过添加回收试验结果显示 (表2)，氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺、霜霉威在叶用莴苣中的平均回收率在85%～106%之间，RSD 在1%～18%之间，均符合中国和欧盟残留分析试验准则[14-15]要求。

表2 霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺在叶用莴苣中的添加回收率及相对标准偏差Table2 The recoveries and RSDs of propamocarb, fluopicolide and 2,6-dichlorobenzamide in leaf lettuce

2.3 残留消解动态和最终残留量测定结果

2.3.1 残留消解动态 结果 (表3) 显示，随着施药后时间增加，叶用莴苣中目标化合物的残留量呈明显下降趋势，符合一级反应动力学方程[18]。其中，2,6-二氯苯甲酰胺的残留量低于定量限(0.02 mg/kg)，与前人在黄瓜上的研究结果一致[8]。于末次施药后10 d，氟吡菌胺和霜霉威消解率分别为81%～84%和73%～78%。氟吡菌胺在叶用莴苣中的半衰期为3.9～4.2 d，与前人在番茄 (2～4 d)[3]和黄瓜 (2～3.3 d)[8]上的研究结果类似；本研究中霜霉威的半衰期为4.8～4.9 d，与其在番茄、马铃薯、黄瓜、人参和烟草上的半衰期 (1.29～11.46 d)[2-3,10,12-13,19]差别较大，可能与试验时的气候、作物等因素有关。

表3 霜霉威、氟吡菌胺在叶用莴苣中的消解动态Table3 Dissipation dynamic of propamocarb, fluopicolide in leaf lettuce

2.3.2 最终残留量 由表4 可知：当采收间隔期为5 d 时，叶用莴苣上氟吡菌胺和霜霉威的残留量分别为4.88～8.51 和13.6～33.1 mg/kg。而2,6-二氯苯甲酰胺在叶用莴苣中的残留量均低于定量限(0.02 mg/kg)。中国国家标准中规定氟吡菌胺在叶菜类蔬菜上的最大残留限量 (MRL) 为30 mg/kg，但尚未制定霜霉威在叶用莴苣或相关叶菜上的MRL 值。CAC 规定叶用莴苣上霜霉威的MRL 值为100 mg/kg。参照以上数据，结合叶用莴苣的生长特点和消费习惯，推荐687.5 g/L 氟菌 · 霜霉威悬浮剂在叶用莴苣上的采收间隔期为5 d。

表4 霜霉威、氟吡菌胺和2,6-二氯苯甲酰胺在叶用莴苣中的最终残留量Table4 Terminal residue of propamocarb, fluopicolide and 2,6-dichlorobenzamide in leaf lettuce

3 结论

建立了采用QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱同时测定叶用莴苣中氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺和霜霉威残留量的分析方法，比较了不同酸碱度提取体系对氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺和霜霉威提取回收率的影响，考察了分散固相萃取吸附剂种类 (C18、PSA、GCB 和MWCNTs) 及其用量对净化效果的影响，优化了前处理提取和净化的过程。该方法简单、高效、准确。通过以多壁碳纳米管为吸附材料的分散固相萃取，有效地实现了样品净化，通过基质匹配标准溶液外标法定量，方法验证结果符合中国《农作物中残留试验准则》要求。运用所建立的方法检测上海地区温室条件下叶用莴苣中氟吡菌胺、2,6-二氯苯甲酰胺和霜霉威的残留量。结果表明，氟吡菌胺和霜霉威在叶用莴苣中的消解趋势符合一级反应动力学方程，半衰期分别为3.9～4.2 和4.8～4.9 d。当样品采收间隔期为5 d 时，叶用莴苣中氟吡菌胺和霜霉威的残留量分别为4.88～8.51 和13.6～31.1 mg/kg。其中氟吡菌胺的最终残留量低于中国制定的其在叶菜类上的MRL 值 (30 mg/kg)；霜霉威在叶用莴苣的最终残留量低于CAC 制定的其在叶菜类上的MRL 值 (100 mg/kg)，而2,6-二氯苯甲酰胺在叶用莴苣中的的残留量均低于定量限 (0.02 mg/kg)。