侵袭性感染婴儿的B群链球菌血清学分布及相关耐药基因研究

杜琴，吴猛贤，施桥发，余晓君，刘发娣，柯江维

（1.江西省儿童医院检验科，江西 南昌 330006；2.江西省中医药大学附属医院，江西 南昌 330006；3.南昌大学基础学院，江西 南昌 330006）

B群链球菌（group B streptococcus,GBS），又称为无乳链球菌（S.agalactiae），是一种定植在人类下消化道及泌尿生殖道的细菌，健康人群带菌率为15%～35%，是导致围产期母亲及新生儿严重感染的重要致病菌之一[1-2]。根据婴儿GBS发病时间分为早发型（GBS-EOD）和晚 发型（GBS-LOD）。EOD是指感染发生在出生后6 d内，晚发型为7 d至3个月内，GBS侵袭性感染可引起新生儿或婴儿肺炎、脓毒血症、脑膜炎等，具有致残率和病死率较高的特点[3]，欧美等发达国家对GBS感染相关疾病负担非常重视。我国大部分研究局限于孕产妇定植菌株的研究，婴儿GBS侵袭性感染数据仍较缺乏。为了解本地区婴儿GBS侵袭性感染菌株血清学分布特点及耐药基因携带情况，特展开此研究。

1 资料和方法

1.1 研究对象 收集江西省儿童医院患儿无菌部位分离获得的GBS菌株62株，纳入标准为⑴发病年龄为0～1岁的婴儿；⑵侵袭性GBS感染即无菌体液或组织分离培养GBS阳性的病例；⑶诊断为血流感染及化脓性脑膜炎的患儿。剔除同一患儿不同时间段或不同标本类型分离的相同生物学特征和相同药敏试验结果的GBS菌株。

1.2 细菌培养、鉴定与药敏 患儿的血液、脑脊液等无菌体液标本接种于BD儿童血培养瓶后放置血培养仪进行培养，培养瓶报阳后转种至血平板，35℃、5%CO2培养18～24 h，通过细菌形态学观察，phoneix-100全自动细菌分析系统对细菌进行鉴定及抗菌药物最低抑菌浓度检测（MIC），药敏结果参考美国临床和实验室协会指南（CLSI-100）2021年标准进行判读。质控菌株为金黄色葡萄球菌（ATCC25923）。

1.3 诱导型克林霉素耐药试验 （D试验） 按照2021版CLSI-100采用双纸片法对红霉素耐药、克林霉素敏感的GBS菌株进行耐药表型检测。细菌对红霉素和克林霉素均耐药，即为结构性耐药表型（cMLSB）；若红霉素耐药，靠近红霉素处克林霉素抑菌圈出现减少或截平，报告D试验阳性，结果为红霉素诱导克林霉素耐药表型（iMLSB）；若对红霉素耐药而克林霉素抑菌圈无减少或截平，即M表型。若克林霉素耐药而红霉素敏感，即为L型。

1.4 细菌DNA提取和PCR扩增 采用煮沸法提取细菌DNA。普通PCR方法检测红霉素耐药基因ermA、ermB、mefA/E；克林霉素耐药基因linB；四环素耐药基因tetO、tetM、tetL、tetK及荚膜血清型cps基因，引物参考文献[4-6]设计。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶180 V电泳30 min后，Gel DOC凝胶成像系统观察结果。

1.5 统计学方法 采用SPSS23.0软件进行分析，两组间的比较采用χ2检验或fisher精确概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GBS荚膜血清型分布62例GBS感染病例中早发型29例，晚发型33例。其中单纯血培养阳性40例，脑脊液培养阳性9例，血和脑脊液同时检出GBS菌株13例。62株GBS共检出Ⅰa、Ⅰb、Ⅲ、Ⅴ4种荚膜血清型，其中Ⅲ型32株（51.6%）为最常见血清型，其余依次为Ⅰb型21株（33.6%），Ⅰa型8株（12.9），Ⅴ型1株（1.6%）。GBS-EOD血清型分布依次为Ⅲ型13株（44.8%）、Ⅰb型12株（41.4%）、Ⅰa型3株（10.3%）、Ⅴ型1株(3.4%)；GBS-LOD血清型分布依次为Ⅲ型19株（57.6%）、Ⅰb型9株（27.3%）、Ⅰa型5株（15.2%）、早发型和晚发型血清型分布无显著差异。22株脑脊液GBS菌株中Ⅲ型14株（63.6%）、Ⅰb型7株（31.8%）、Ⅰa型1株（4.5%）。

2.2 药敏试验及耐药基因检测结果 62株GBS菌株对青霉素、头孢噻肟、利奈唑胺、万古霉素均敏感；对红霉素、克林霉素、四环素、左氧氟沙星耐药率为83.9%、80.6%、69.4%、17.7%。各血清型耐药率，见表1。52株红霉素耐药菌株中cMLSB 49株；M型3株，未检出iMLSB型;L耐药表型检出2株。红霉素耐药基因ermB检出率最高约86.5%（45/52），44.2%菌株检出mefA/E，ermB与mefA/E可单独存在也可并存，3株M表型菌株均单独携带mefA/E基因；未检出ermA基因,linB基因检出率32.0%。四环素耐药基因以tetO和tetM为主，未检出tetL和tetK。血清型与耐药表型基因检出类型具体，见表2。

表1 62株GBS耐药性与血清分型相关性

表2 GBS不同血清型与红霉素、四环素耐药基因分布

3 讨论

1970年GBS被发现可引起新生儿早发型感染，后期研究表明EOD最常见的发病机制是母体胃肠道和泌尿生殖道中存在的GBS在子宫腔的上升定植，感染发生于随后的胎儿定植和或胎儿吸入感染的羊水[7]。这种发病机制主要发生在足月儿分娩期间，早产儿感染的时机不大确定，可能是胎膜早破和或早产过程中发生[8]。GBS阳性母亲产下的新生儿大约50%存在B群链球菌定植，其中1%～2%将发展为GBS早发型[9]。20世纪90年代，发达国家推荐的GBS产前筛查及分娩期预防性使用抗菌药物（IAP）,有效减低了新生儿GBS感染的发病率和病死率,德国研究数据[10]显示GBS-EOD下降率大约为80%，EOD与LOD比例由80:20下降至60:40，美国GBS-EOD发病率由1.8每1000活产儿降至2015年0.23每1000活产儿，然而LOD却无明显下降趋势[11]。LOD发病机制目前尚不清楚，有研究认为部分LOD发生与母体内GBS定植和母乳喂养有关[12]，IAP的实施可能降低母亲体内GBS定植密度,但是并没有影响母体定植的状态[13],大多数阳性的产妇8周后仍然检测到GBS重新定植[14]。也有学者认为LOD病例中母体并不普遍存在GBS定植，照料人的水平传播同样能引起婴儿GBS感染[11]。目前普遍认为通过在妊娠早期提供疫苗保护比任何产时的预防更加有效，它能够提供一个长期的更有效的免疫，即使在GBS-LOD感染也同样有保护作用。迄今为止，作为GBS血清分型系统为基础的含唾液酸的荚膜多糖（CPS）一直是大多数疫苗开发的重要关健点。目前覆盖五种血清型（Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、V）的多价结合疫苗已经在3期临床试验阶段[15]。

荚膜多糖抗原是GBS主要的毒力因子之一，根据荚膜多糖成分不同，可将GBS分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ-Ⅸ，共10种血清型。RUSSELL等学者对全球已发表的相关数据进行mete分析，结果显示孕产妇定植血清型存在明显的地域差异，如Ⅲ型血清型在亚洲分布较低，而VI、VII、VIII等少见的血清型更为常见；在非洲境内，西非比其他地区更经常报告V型[16]。SHABAYEK调查结果显示，美国和欧洲存在的定植菌株主要为Ⅰa、Ⅰb、Ⅲ和V血清型，IV和V分别在阿拉伯和埃及占主导地位，而VI和VIII型在日本孕妇中普遍流行[17]。我国台湾地区数据表明VI型为孕产妇主要定植型，而引起婴儿侵袭性感染的菌株血清型以Ⅲ型为主，其次为Ⅰa型[18]。江西省妇幼保健院数据显示孕产妇携带GBS血清型较多，以Ⅰb型和Ⅲ型为主，其次为Ⅰa、V、Ⅱ、IV和IX[19]。本研究发现，婴儿侵袭性菌株共四种血清型，依次为Ⅲ型51.6%、Ⅰb型33.6%、Ⅰa型10.3%、Ⅴ型3.4%；国内林雅茵报道厦门地区患儿血清型分布依次为Ⅲ型59.0%、Ⅰa型15.7%、Ⅰb型14.5%、Ⅱ型4.8%、Ⅴ型3.6%[20]；中国婴儿GBS感染多中心前瞻性研究结果发现，Ⅲ型（61.5%）和Ⅰb(28.7%)为主要血清型，其次为少量的Ⅰa（15.7%）、Ⅴ（7.0%）、IV和VI各(0.4%)及1例未定型，并且各地区血清学分布较相似，北部和东北部由血清型Ⅰb引起的比例高于其他地区[21]。Madrid认为全球不同区域引起婴儿患病的流行血清型是较相似的，仅有轻微的变化，以血清型Ⅲ为主导，Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和V型覆盖97%的菌株[22]。婴儿侵袭性菌株血清型可能更具有特点，与定植型GBS之间的血清学和遗传学关联值得进一步探讨。

本研究显示早发和晚发型均以血清型Ⅲ型最常见，占比约44.8%和57.6%。脑脊液标本GBS菌株Ⅲ型约63.6%，与中国学者Ji研究数据[21]较接近，德国和意大利数据显示80%以上的GBS化脓性脑膜炎由Ⅲ型血清型引起，并且Ⅲ型与LOD也存在明显相关性[23-24]。血清Ⅲ型GBS比其他血清型更能引起侵袭性疾病，Ⅲ型多糖末端唾液酸残基的存在抑制了补体替代途径的激活，从而抑制了对GBS的吞噬作用[25-26]。

在中国广泛使用红霉素和克林霉素带来的高耐药率给青霉素过敏的患儿临床用药带来极大的挑战，本研究GBS菌株对红霉素和克林霉素耐药率分别为83.9%和82.6%。近期关于中国孕产妇的研究报道GBS对红霉素和克林霉素的耐药率72.0%、66.4%[27]，低于本研究。GBS菌株对红霉素的主要耐药机制是由erm基因介导的核糖体靶位点甲基化修饰，从而引起细菌MLSB交叉耐药，此外，GBS对红霉素的耐药机制还包括mefA/E基因介导的外排作用，导致细菌对14.15元大环内酯耐药。本研究显示GBS红霉素耐药株最主要的表型为cMSLB,主要由ermB和（或）mefA/E基因介导，与聂署萍和何其励等研究相符[5-6]，在伊朗和韩国,ermB和ermA/TR是大环内酯类药物耐药的主要基因[28-29],ermA/TR主要介导iMLSB型耐药[12]，本次尚未检出。mefA/E基因介导的外排泵即使在红霉素的存在下，并不能泵出克林霉素及林可内酰胺类药物，本实验中3株M型菌株均单独携带mefA/E基因。血清型与耐药表型及基因的相关性分析显示，21株Ⅰb型均为cMLSB表型且均携带ermB和tetO基因；血清型Ⅰb型和Ⅲ型较Ⅰa型对红霉素、克林霉素及四环素表现出较高的耐药率，差异有统计学意义；全敏感菌株4株有3株为Ⅰa型。V型被报道具有获得大环内酯类药物耐药性[12]，但因检出菌株检出较少无法获得比较数据。

综上所述，引起婴儿侵袭性感染的GBS菌株血清型分布较集中，以Ⅲ型最常见。本研究局限性在于菌株仅来源于江西省儿童医院，样本量较少，但研究对象为侵袭性感染患儿，血清学分布、耐药性及基因的研究对疫苗的研发和推广、临床制定防治婴儿GBS感染方案具有重要的指导价值，对预防和控制耐药株的产生和传播至关重要。