某粉壳蛋鸡场禽流感、新城疫免疫抗体检测及禽流感H7亚型病原学调查

林明星，余见栋

（平阳县畜牧兽医管理中心，浙江 平阳325400）

粉壳蛋鸡是指由洛岛红品种与白来航品种的品系间杂交所产生的蛋鸡，具有蛋重小、产蛋多、死淘低、体重适中、生活力强、适应性好、性情温顺等特点[1]。其蛋呈浅褐色，介于褐壳蛋与白壳蛋之间，外观、口感、营养价值等方面与土鸡蛋相近，且产蛋量较放养土鸡高，近年来对这种鸡的需求量有增加的趋势。禽流感（Avian fluenza，AI）是由A型流感病毒引起的一种以禽类感染为主的传染性疾病[2]，根据其不同的致病性可分为低致病性禽流感和高致病性禽流感。新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒引起的一种高度接触性、急性、烈性传染病[3]。禽流感和新城疫是禽类养殖过程中较为常见的两种病毒性传染病，可引发禽类呼吸道感染、产蛋量等生产性能下降、继发其他疫病等，严重的还会导致急性死亡[4]，严重危害养禽业的发展。H7亚型禽流感是高致病性禽流感，不仅感染禽类还可感染人，是一种人畜共患病，具有公共卫生意义。大量研究[5-6]和实践证明，应用疫苗的免疫接种可有效预防和控制这两种疾病的发生与流行。为了解平阳地区某蛋鸡养殖场禽流感和新城疫免疫效果及禽流感H7亚型病毒感染状况，提高养殖场对禽流感和新城疫免疫的重视，减少这两种疫病的发生，于2018—2020年每3个月对该规模粉壳蛋鸡养殖场进行采样，检测其禽流感、新城疫免疫抗体水平及禽流感H7亚型病原，旨在了解养殖场的禽流感和新城疫的免疫及禽流感H7亚型病毒感染情况，为养殖场制订科学的免疫程序提供参考依据，在这两种疾病的防控中提供一些思路和参考。

1 材料

1.1 样品

2018—2020年对平阳县某规模粉壳蛋鸡养殖场开展每季度1次共10次的采样和流行病学调查工作，共采集血清样品、鸡喉肛棉拭子各329份。

1.2 养殖场的免疫情况

7日龄，鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗饮水；14日龄，传染性法氏囊病活疫苗滴鼻，鸡痘翅内穿刺；23日龄，传染性法氏囊病活疫苗饮水；33日龄，鸡新城疫活疫苗饮水；53日龄，鸡新城疫活疫苗饮水；63日龄，重组禽流感病毒（H5+H7）灭活疫苗皮下注射；73日龄，重组禽流感病毒（H5+H7）灭活疫苗皮下注射；之后每隔40 d鸡新城疫活疫苗饮水1次。

1.3 主要试剂

血凝抑制试验用禽流感H5亚型、禽流感H7亚型、新城疫病毒抗原及标准阳性血清，购自哈尔滨维科生物技术有限公司、青岛易邦生物工程有限公司；禽流感病毒H7N9亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒，购自哈尔滨国生科技股份有限公司；红细胞悬液用PBS配成1%鸡红细胞悬液，阿氏液、磷酸盐缓冲液（PBS），按相关方法自行配制，4℃冰箱保存，备用。

1.4 仪器设备

微量移液器（规格为10μL、100μL、200μL等）、ABI Step One荧光定量PCR仪等，96孔V型微量板、一次性滴头等，均购自杭州杰萌动物疫病防控科技有限公司。

2 方 法

2.1 血清学检测

禽流感和新城疫免疫抗体检测按照《禽流感诊断技术》（GB/T 18936—2003）、《新城疫诊断技术》（GB/T 16550—2008）规范进行，采用血凝（HA）试验检测标准抗原的血凝价，制备4单位抗原并验证，采用血凝抑制（HI）试验分别检测血清样品的禽流感（H5、H7）及新城疫抗体效价，每次检测的抗体效价以lg值表示。

2.2 病原学检测

禽流感的病原学检测按照《H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》（GB/T 19438.3—2004）进行，每次检测结果以Ct值表示。

2.3 结果判定与统计分析

新城疫抗体效价≥5 lg、禽流感HI抗体效价≥4 lg判定为免疫合格，Ct值≤35为H7N9亚型禽流感病毒核酸阳性。利用Excel软件进行数据平均值、标准差和合格率等的统计分析。

3 结果与分析

3.1 血清学检测结果

通过2018—2020年每3个月对该规模粉壳蛋鸡养殖场进行采样，检测其禽流感、新城疫免疫抗体水平，共检测10个批次329份产蛋鸡血清样品。其禽流感H5亚型10个批次的样品免疫合格率均在83%以上，免疫抗体效价平均值在5.69～9.49 lg之间；禽流感H7亚型有9个批次的样品免疫合格率在83%以上，免疫抗体效价平均值在4.87～9.37 lg之间，仅2018年第一季度的样品免疫合格率低于70%；新城疫10个批次的样品免疫合格率均在94%以上，免疫抗体效价平均值在8.51～10 lg之间，具体检测结果见表1。不同批次时间段样品的免疫抗体效价均值变化趋势见图1，从图1中可知，禽流感、新城疫免疫抗体水平各批次之间存在差异，其中禽流感H7亚型波动较大，新城疫则较为平稳。

3.2 病原学检测结果

通过2018—2020年每3个月对该规模粉壳蛋鸡养殖场进行采样，共采集329份鸡喉肛棉拭子样品进行H7亚型禽流感病原学检测，结果H7亚型禽流感病原学检测阳性数为0，无H7亚型禽流感阳性样品，具体检测结果见表1。

表1 禽流感、新城疫免疫抗体及禽流感病原学检测情况

图1 不同批次时间段样品的禽流感、新城疫免疫抗体效价均值变化情况

4 讨 论

由血清学检测结果可知，除2018年第一季度外，禽流感H5亚型、H7亚型和新城疫免疫合格率均达到国家规定的规模养殖场免疫抗体合格率75%以上的水平。禽流感被列入重大动物疫病强制免疫计划，政府统一采购疫苗，在2018年之前使用的是H5亚型的禽流感疫苗，这可能是导致2018年第一季度H7亚型禽流感免疫抗体效价低的原因。该养殖场免疫效果最理想的是新城疫，通过其免疫程序可知，该养殖场使用新城疫活疫苗免疫次数频繁。使用新城疫活疫苗饮水免疫，除疫苗本身外影响其免疫效果的因素众多，比如稀释用水、容器、饮水时间等[7]，重复多次的免疫可以提高免疫抗体水平，同时因活疫苗易发生生物污染带来一定的风险，过度免疫也使养殖成本增加。根据相关研究[8-9]，为避开母源抗体对疫苗免疫效果的不良影响，但不迟于母源抗体低于临界值，蛋鸡禽流感首次免疫应在10～21日龄，该养殖场首免在63日龄，存在免疫空白期，应提早首免日龄。总体上看该规模蛋鸡养殖场注重疫苗的免疫，免疫程序实施基本到位但需进行适当调整。

经H7亚型禽流感病原学检测，3年来检测结果均为阴性，表明该规模蛋鸡养殖场在生物安全管理、防控措施落实等方面均比较到位，有效降低了疫病发生风险。

禽流感病毒感染人的情况时有发生，自2013年报道上海出现首例人感染禽流感病例以来，截止到目前共发生5次大流行，据中国疾病预防控制中心统计，截至2019年9月1日，H7N9亚型禽流感作为一种严重人兽共患病，已造成1 626人感染，624例死亡，其中有禽类接触史的有201名患者，严重威胁我国公共卫生安全[10]。鉴于H7N9亚型禽流感的严峻态势，为控制病毒的传播，2017年9月农业农村部启动了家禽H7N9亚型禽流感疫苗接种计划。目前H7N9亚型禽流感流行趋势基本得到控制，但是新的H7N9病毒基因型还在出现，仍然需要给予重点关注。本次专项监测，采用每3个月1次的抽样方案，可更及时了解规模禽场的禽流感和新城疫的免疫效果和禽流感H7亚型病毒感染状况，尽早发现防控工作中的隐患，具有更强、更有针对性的技术指导意义。