安图质谱仪与生化反应鉴定血液分离念珠状链杆菌的价值

黄丽月，韦国文

广西河池市人民医院 （广西河池 547000）

念珠状链杆菌是一种革兰阴性杆菌兼性厌氧菌，对营养要求较高，在含有血液（15%的羊血或兔血最理想）、血清、腹水或卵黄的强化培养基上生长良好，且生长需要5%～10%二氧化碳，最适生长温度为35～37 ℃，故巧克力平板较血平板上的菌落大[1]。该菌自然寄居在野生动物或啮齿类动物的鼻咽部和口咽部，通过鼠咬伤引起鼠咬热或污染水和食物引起哈弗里尔热，并常在感染者的血液、滑膜积液、脓肿吸出物中分离到，对实验小白鼠、灵长类等有极强的致病性[2]。其引起的鼠咬热潜伏期一般为1～5 d，典型的临床表现有骤然高热、肌痛、关节痛、呕吐及头痛，随后四肢出现斑丘疹[3]。近年来，由念珠状链杆菌引起的临床病例均有报道[1，4-7]，但该菌对营养要求较高，生长缓慢，生化反应不明显，常规方法鉴定不出或鉴定错误，故易出现漏诊，或被当作污染菌，甚至误诊。

近年来，随着质谱分析法的快速发展，质谱技术愈加成熟，细菌鉴定时间缩短至2 h 以内，同时对疑难杂菌的鉴定有较高的属水平符合率[8-11]，可为患者治疗提供及时、可靠的依据。本研究采用安图AUTOF MS1000质谱仪，结合传统的生化实验，对我院一起血液感染的细菌进行了鉴定，发现了由念珠状链杆菌引起的临床感染，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

患者女，30岁，2020年4月10日因“畏寒，发热半天”入院，否认野生动物接触史及外伤史，曾于2019年7月10日在我院就诊，检测出α地中海贫血CS型点突变纯合子，CD55、CD59阴性，有输血史；查体体温40.2 ℃，贫血貌，全身巩膜黄染，关节疼痛，偶见皮疹；实验室检查白细胞计数9.86×109/L，中性粒细胞百分比75.60%，淋巴细胞百分比19.60%，红细胞计数1.26×1012/L，血红蛋白37 g/L，血细胞比容11.90%，C反应蛋白5.0 mg/L，降钙素原4.07 ng/ml；入院诊断发热原因待查及α地中海贫血，入院后立即抽取左、右上肢静脉血进行细菌培养，第3天左、右上肢血培养均报阳性，转种平板培养，直接涂片镜下均为革兰阴性杆菌，培养3 d后观察，左、右上肢的血平板、巧克力平板肉眼可见大小、形态较为一致的细小菌落，根据患者病情，予以输血及莫西沙星经验抗感染治疗，感染加重，持续高热，感染指标高，经考虑感染控制不住，结合药敏实验结果及经临床药学副主任药师会诊后，建议使用头孢曲松钠（注射剂），经治疗患者病情好转，持续用药1周后，再次抽取左、右上肢血进行细菌培养，培养7 d后结果为阴性，临床症状明显好转，予以带药出院。

1.2 仪器与试剂

安图AUTOF MS1000质谱仪购自深圳安图公司；VITEK2-compact 全自动生化鉴定药敏仪购自法国梅里埃公司；全自动血培养仪及配套需氧培养瓶购自珠海迪尔公司；哥伦比亚血平板、巧克力平板、麦康凯平板购自郑州安图公司；革兰染液购自杭州滨和试剂公司；生化管、药敏纸片购自杭州滨和试剂公司；质控菌株包括大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853，均来自杭州滨和试剂公司。

1.3 标本采集与处理

参照《临床检验操作规程》第4版中的细菌鉴定方法，遵循无菌操作原则，分别取患者左、右上肢静脉血于需氧培养瓶内，待血培养报阳性后转种血平板、巧克力平板、麦康凯平板。

1.4 细菌鉴定

1.4.1 安图质谱仪鉴定

取一次性接种环分别挑取左、右上肢培养出的菌落涂布在质谱检测孔内，室温干燥，各加入1 μl 裂解液（主要成分为甲酸），待干燥后再分别加入1 μl 基质液（主要成分为肉桂酸），干燥后上机测定。

1.4.2 生化反应鉴定

取针样接种环分别挑取左、右上肢培养出的菌落做氧化酶、触酶、脲酶、硝酸盐还原和吲哚试验及精氨酸、葡萄糖、麦芽糖等系列生化管反应；分别挑取左、右上肢培养出的菌落，配置成0.5麦氏菌悬液，取VITEK2-compact 细菌鉴定卡片，吸样上机孵育8 h 后观察结果；药敏选择纸片扩散法进行试验。

2 结果

2.1 细菌培养及镜检

左、右上肢血培养报警阳性后，转种血平板、巧克力平板、麦康凯平板，1 d 后观察，左、右上肢的所有平板均无肉眼可见菌落；2 d 后观察，左、右上肢的血平板和巧克力平板肉眼可见针尖样大小菌落，形态不明显，麦康凯平板均不生长；3 d 后观察，左、右上肢的血平板和巧克力平板可见圆形、平滑、奶酪样的灰色菌落，直径1～2 mm；4～5 d 后观察，陈旧培养基中菌落类似支原体油煎蛋样外观，中心紧密并深入琼脂（L 型菌落）；5 d 后镜下为革兰阴性杆菌，形态多样，长短不一，呈球形、球杆形、杆形、梭形、长条形，长度1～5 μm，陈旧培养基染色后镜下可见100～150 μm 的丝状体。

2.2 安图AUTOF MS1000质谱仪鉴定结果

经安图AUTOF MS1000质谱仪鉴定，左上肢细菌鉴定为念珠状链杆菌，最高得分为98.53分；右上肢细菌鉴定亦为念珠状链杆菌，最高得分为95.28分。

2.3 生化鉴定结果

VITEK2-compact 全自动生化鉴定药敏仪对左、右上肢培养出的细菌均鉴定不出。该菌生化反应不活泼，其中氧化酶、触酶、脲酶、硝酸盐还原和吲哚试验均为阴性，可水解精氨酸，微弱发酵葡萄糖、麦芽糖。

2.4 药敏结果

根据美国临床和实验室标准协会（C l i n i c a l a n d Laboratory Standards Institute，CLSI）2019药敏标准，以ATCC25922大肠埃希菌为质控菌株，手工分析药敏，结果为氨苄西林6 mm，头孢唑林6 mm，头孢呋辛6 mm，头孢他啶28 mm，头孢曲松28 mm，头孢哌酮/舒巴坦27 mm，左氧氟沙星26 mm，环丙沙星30 mm，复方新诺明24 mm，庆大霉素18 mm，阿米卡星21 mm，亚胺培南30 mm，美罗培南32 mm。根据CLSI 2019药敏标准，该菌无药敏判断标准，临床医师应根据药敏结果并结合患者情况进行用药。

3 讨论

念珠状链杆菌是链杆属中唯一的一种，是Sehotmuller于1914年从鼠咬热患者分离而得，其存在于健康鼠口腔和咽部，为美国鼠咬热的最主要病因。临床已发现，感染的暴发与饮入未消毒的和被污染的牛奶有关，当疾病是以此种方式传播时被称为哈弗里尔热。然而，感染常是由受染的野生大鼠或小鼠咬伤后发病，偶尔感染亦可由鼬鼠和其他啮齿类动物传播，但本研究中的病例并无直接鼠类或其他野生动物接触史，发病迅速突然，有持续性不规则高热、关节炎和皮疹。有研究表明，单独存在的念珠状链杆菌中央可膨胀，而长丝状菌体呈现一系列的膨胀相连，出现念珠状的长链，最后分裂成球杆形，也会自发变成L型，将变异株接种于小鼠体内，可恢复其固有形态[12]。随着抗生素的普遍应用，往往临床病例分离到的是形态各异、染色多变的L型菌株[13]，由于该菌体外培养营养要求较高，生长缓慢，若临床分离中未选择适合的培养基，且培养时间较短，则会造成一定的漏检。

血流感染是临床上重症感染性疾病之一，致死率高，快速诊断是控制感染、降低病死率的关键[14-15]。传统的微生物鉴定方法主要包括培养和生化实验等，耗时长、鉴定范围窄，影响病原微生物鉴定的速度和准确性。念珠状链杆菌作为疑难、少见菌，生化反应不明显，VITEK2-compact 并不提供相应的鉴定卡，普通的GP、GN 卡并不能鉴定出该菌，势必给该病原菌的确诊造成拖延或误诊，从而影响临床治疗效果。

20世纪80年代，质谱被发现可以对核糖体蛋白等大质量生物分子进行分析，鉴于此，质谱仪逐渐被用于细菌检测中。安图AUTOF MS1000质谱仪根据不同细菌所特有的蛋白，应用激光使细胞表面蛋白质形成不同的模式峰，与人类病原菌数据库中的蛋白质指纹图谱进行比较，从而对该微生物的类别进行鉴定，是与传统鉴定方法完全不同的新型鉴定手段。因其高灵敏度和准确度，可为微生物体内含量较高的蛋白质提供细菌属、种、株水平的检测，相较于传统方法更加快速，且操作简单、成本低廉。随着质谱技术的不断发展，鉴定的数据库不断扩充、完善，一些操作简易的商业化质谱仪已经走进临床检验，质谱技术的应用越来越广泛，并有可能成为现代微生物实验室细菌鉴定的常规方法，这对提高临床微生物检验的能力和水平大有裨益。