母儿Rh血型不合孕期监测研究进展

谢梦潇 王 欣

首都医科大学附属北京妇产医院(100026)

人类Rh血型系统是临床最重要的血型系统之一，由C、c、D、E、e抗原组成，由位于1号染色体短臂1P34.3-1P36.1上2个紧密连锁高度同源的RHD和RHCE基因编码。其抗原强弱依次为D>E>C>c>e，由于D抗原性最强，因此根据红细胞上D抗原的有无可分为RhD阳性和RhD阴性。RhD阴性女性接触RhD阳性红细胞而致敏[1]，当D抗原再次进入已致敏的母体循环后，记忆B淋巴细胞在短时间内产生大量可通过胎盘的lgG抗体。这些抗体进入胎儿循环，识别胎儿红细胞表面抗原并与之结合，引发胎儿体内免疫反应，即发生溶血，导致胎儿贫血或新生儿溶血病，造成新生儿不同程度溶血、水肿、黄疸、肝脾肿大等临床症状，严重可造成新生儿死亡[2]。胎儿和新生儿溶血性疾病的治疗取决于胎儿贫血的严重程度。若病情较轻，胎儿可通过增加红细胞生成代偿红细胞的破坏。若病情进一步加重则需要进行宫内输血治疗或剖宫产终止妊娠，胎儿出生后仍需要进行血液交换或完全性的输血治疗。因此，Rh阴性孕妇的孕期监测及新生儿Rh血型的出生前诊断对新生儿溶血病的预防和治疗具有重要意义。

1 Rh阴性孕妇的孕期监测

妊娠30天，RhD抗原作为红细胞膜的一部分被表达且仅存在于红细胞上。母体RhD同种异体免疫发生的原因是母体免疫系统暴露于RhD阳性红细胞中，妊娠女性一旦产生抗D IgG抗体，就会穿过胎盘并对胎儿的红细胞产生调理素作用，胎儿红细胞会在胎脾中被巨噬细胞吞噬。但母体巨噬细胞吞噬RhD血型不合的胎儿的红细跑,需经过一段时间才能释放出足够的抗原,且初发免疫反应发展缓慢,所产生的抗体为不能通过胎盘屏障的IgM,故RhD血型不合溶血病常发生于再次妊娠,其中胎儿-母体输血是同种免疫反应的基础[1]。使用流式细胞仪的研究表明，在几乎所有的妊娠中均有微量(0.1ml)的胎儿红细胞进入母体循环[3]。自发性胎母输血的发生率和出血量随着孕龄的增加而增加，分娩时最高[4]。母胎输血也可能由自然流产、妊娠终止、异位妊娠、侵入性宫内操作、死胎、母体腹部创伤、产前母体出血和外部胎头倒转术导致。

但也有报道称在母体没有明确接触携带D抗原的红细胞情况下，却检测到抗RhD抗原同种抗体[5]。这可能是因为临床上未识别的早期妊娠丢失(包括双胎自然减灭)的结果。另外，还有学者提出病因为“外祖母理论”，即宫内致敏所导致。除母体接触的胎儿血量外，初次免疫应答的发生与否还取决于其他一些因素。这些因素包括母胎输血的次数和母胎是否为ABO血型相容[6]。胎儿红细胞的免疫原性和母亲免疫源应答的能力在发病机制中均起一定作用。

我国汉族人群Rh阴性的概率为0.28%[7]。Rh血清学阴性者接受Rh阳性血液后发生同种免疫者占50%～75%，Rh阴性孕妇发生新生儿溶血症者占其中的5%～7%[8]，随着我国全面两孩政策的实施，Rh阴性妇女面临着再生育问题，加上我国人工流产妇女数量较多，很多Rh阴性妇女有着多次妊娠史，使得其再次妊娠面临很大的风险。

2 母儿Rh血型不合的预防及临床检验

在无免疫预防措施的20世纪50年代，各类型新生儿溶血症的发病率高达1/2200。到了20世纪60年代晚期，随着新生儿预防性注射抗D疫球蛋白的广泛应用，Rh阴性妇女发生D抗原反应的频率从17%降到1%左右[9]。一篇纳入33 715例患者的meta分析显示Rh血型阴性孕妇产前应用D免疫球蛋白可降低致敏率[10]，胎儿出生前进行预防性抗D治疗可以将免疫反应降至0.2%[11]。目前抗D免疫球蛋白的作用机制尚未明确，其可能并不是靠清除所有胎儿RhD阳性红细胞而发挥作用，还可能具有阻止免疫起始阶段的作用。目前国内外采用的标准预防方案是对于所有Rh阴性孕妇，不论胎次及胎儿血型，均推荐在孕28周，分娩后72 h内，以及流产、绒毛取样、羊膜腔穿刺等胎儿血液暴露事件后常规注射抗-D免疫球蛋白。该方案大幅降低了胎儿与新生儿Rh相关溶血性疾病的发生，但也导致38%的孕有Rh阴性胎儿的孕妇接受不必要的抗-D免疫球蛋白注射，以及相关的用药风险(过敏反应、血液传播疾病)和治疗费用的增加[12]。虽然抗-D抗体是引起绝大数胎儿与新生儿Rh相关溶血的原因，但Rh抗原-抗体系统中的抗-C、抗-E抗体可导致另一部分Rh溶血，且比例逐渐上升，有研究报道发生新生儿溶血症以抗-E抗体居多[13]，而针对上述抗体目前尚无有效的预防方案[12]。

用于母体的抗D免疫球蛋白可通过胎盘进入胎儿体内,这些抗体也有使胎儿发生溶血的风险。研究发现,在足月RhD阳性新生儿中,有20%直接抗人球蛋白试验阳性,但是并无发生溶血的证据[14]。考虑到RhD阴性母亲在28孕周时常规使用抗D免疫球蛋白,此时高抗体滴度可能增加28孕周左右出生的早产儿的溶血风险。随后在早产儿中进行的回顾性研究结果也未见溶血相关表现[15]。

自从认识到母儿Rh血型不合的危害后，产科医生高度关注，一直期望发现早期诊断的方法。目前临床上常用的诊断方法是超声监测、大脑中动脉血流监测、孕期血型抗体监测、羊水胆红素检查等手段。但对此不能准确做出诊断与评估，只是间接根据监测结果推断否存在母儿血型不合以及胎儿溶血的程度。

2.1 超声监测

严重贫血可以导致胎儿水肿，其发生机制可能为贫血导致胎儿心脏输出量增加和髓外红细胞生成(大部分位于肝脏)。严重贫血导致高输出性心力衰竭和门静脉系统高压从而导致胎儿水肿。如果胎儿血红蛋白缺乏程度为胎龄相应均值以下至少7g/dl(相当于血细胞比容低于约15%或血红蛋白<5g/dl)，则会发生积水[16]。胎儿水肿临床表现出现至少下列两种情况：皮肤水肿、腹水、心包积液和胸腔积液。一项对156例超声发现胎儿水肿病例的回顾性分析显示，胎儿存活率为17.9%(28/156)，其中3例原因为母儿Rh血型不合引起的水肿，2例死亡，1例失访[17]。严重水肿者围生儿病死率可高达50%～100%[18]。因此当B超出现胎儿胸水、腹水、心胸比例增大、肝脏肿大、胎儿皮肤水肿、胎盘增大、羊水增多、胎儿畸形等典型的溶血性水肿表现时，胎儿的预后很差[19]。

近年来研究发现胎儿大脑中动脉多普勒超声值异常可以在胎儿水肿发生前识别胎儿贫血。多普勒超声对胎儿大脑中动脉(MCA)收缩期峰值流速(PSV)的评估是基于胎儿血红蛋白水平决定MCA血流的原理：随着胎儿血红蛋白水平下降，MCA-PSV升高。一项包括9项观察性研究在内的系统性综述表明,多普勒超声检查MCA-PSV可以作为筛查任何病因导致严重胎儿贫血的工具[20]。重度贫血为胎儿血红蛋白<0.55MoMs，多普勒超声检查MCA-PSV评估的敏感性和特异性分别为75.5%和90.8%；对111例因母体红细胞同种免疫而有贫血风险的胎儿进行联合穿刺术和MCA-PSV检测，并与265例正常胎儿的血红蛋白水平进行了比较，结果无论有无胎儿水肿，MCA-PSV升高(>1.5MoMs)对预测中度或重度贫血的敏感性为100%(95%CI 86～100)，假阳性率为12%[21-22]。一项前瞻性研究显示，MCA-PSV为中度到重度贫血(血红蛋白水平<0.65MoMs)的敏感性为88%，特异性为87%，阳性预测值53%，阴性预测值98%[22]。

MCA-PSV检查的时间间隔应取决于先前的病史、孕周以及MCA-PSV检测的MoM值。应持续监测并延长至可进行胎儿血液采样或宫内输血的孕周，通常为孕 18～20 周。专家建议根据临床经验和已知的进展情况，每隔1～2周监测胎儿贫血的进展，当接近1.5MoMs时，监测频率应增加[21]。MCA-PSV的测量技术很重要，应在胎儿处于安静的行为状态时进行，因为当胎儿处于活动状态时，测量结果存在误差[23-24]。

母胎医学协会和美国妇产科学院指南指出，MCA-PSV≤1.5MoMs无中度至重度贫血。如果维持在这一水平，可在妊娠37+0～38+6周分娩[25]。且从妊娠32周开始应每周进行产前检查，严密监测胎儿情况。

2.2 间接抗球蛋白检测

对于Rh阴性孕妇首次就诊时应进行间接抗球蛋白检测判断孕妇是否致敏。阳性则为已致敏，阴性为未致敏。根据既往妊娠史可将孕妇分为首次致敏和再次致敏。对于首次致敏者，若抗体滴度稳定，则每月监测即可；若滴度升高则应每2周监测，直至达到临界滴度。临界滴度是指在特定机构背景下与发生重度贫血和胎儿水肿风险相关的滴度。低于临界滴度，胎儿有发展成轻度至中度贫血的危险，但不会很严重。目前认为抗D的滴度以16～32为临界值，欧洲和英国设定临界值为15U/ml[26]。如果达到或超过临界滴度，则需要通过测定多普勒MCA-PSV进一步评估胎儿是否贫血。

连续的滴度测定应由同一实验室进行，因为实验室间存在滴度差异。虽然实验室内滴度差异也可能存在，但在某一特定实验室重复检测时，对于真正稳定的滴度，其变异性不超过1个稀释度。即滴定度呈现4倍增加时才很可能代表真实的增加。

间接抗球蛋白检测仅是对于初次致敏者的筛查手段，而不能诊断胎儿是否发生溶血及预测溶血是否进展。即使低于临界滴度，胎儿也有发生贫血的风险。对于再次致敏者，间接抗球蛋白检测抗体滴度不足以评估胎儿发生溶血的风险，因此孕期不建议监测抗体滴度[2]。

2.3 羊膜穿刺术测定羊水胆红素(AFB)水平

羊膜穿刺术测定AFB水平是间接估计胎儿贫血严重程度的传统方法。AFB来源于胎儿肺部和气管的流出物，与胎儿溶血程度有关[27-28]。高恩钰等[29]研究表明，新生儿溶血的发病和严重程度与AFB含量密切相关，正常妊娠AFB在20～23孕周出现峰值达4.104umol/L，以后逐渐下降，至30孕周后渐趋于0，基本上与国外报道相符；含量的峰值估计与胎儿红细胞的生成量和胎肝成熟度有关，34孕周后AFB>17.1umol/L，提示胎儿红细胞极度破坏，危及胎儿生命，当羊水L/S比值>2.0时，建议临床应考虑立即终止妊娠；AFB>8.55umol/L而<17.1pmol/L反映胎儿红细胞破坏严重，当羊水羊水卵磷脂/鞘磷脂比值(L/S)>2.5时，临床可考虑提早终止妊娠；AFB<8.55pmol/L估计胎儿红细胞可能受累，但破坏不严重，临床可根据孕妇健康状况,考虑等待自然分娩。胎儿的血液样本可以精确地确定胎儿贫血的严重程度，但这一过程有1%～2%的胎儿死亡风险，其中胎龄较低和积水胎儿的风险最高。因此AFB水平和连续的胎儿血液检测目前很少用于筛查胎儿贫血情况。

2.4 出生前确定胎儿RhD血型

出生前确定胎儿RhD血型即首先明确胎儿是否有风险，再有针对性的个体化进行孕期监测管理。RhD阴性胎儿因为不携带目标抗原，从而不存在溶血风险。如果胎儿的生父是RhD阴性，则胎儿也必定是RhD阴性。母亲的同种异体免疫是由于先前与RhD阳性伴侣怀孕或其他来源的RhD阳性红细胞(如不相容输血、共用针头)所致。RhD阴性胎儿不存在溶血性疾病的风险，没有必要进行进一步的评估、监测和干预，除非发生了涉及非RhD红细胞抗体的母体同种免疫[30]。

如果胎儿的生物学父亲是RhD阳性，需要确定父亲的合子率。所有RhD阳性纯合子的后代均为RhD阳性，因此无需对胎儿RhD型进行进一步检测。杂合子产生RhD阴性后代的几率为50%，在这种情况下，需要确定胎儿Rh(D)类型。胎儿RhD型别检测可以通过有创和无创两种方式。

2.4.1脐血穿刺确定胎儿Rh血型传统的胎儿产前诊断检测胎儿Rh血型是通过脐静脉穿刺，采集脐血进行细胞核型分析获取胎儿染色体信息，有创检测的准确率为98%-99%，但伴有0.5%～1.0%的流产风险，同时也会伴有羊水渗漏、宫内感染等风险[19]。且其技术要求高，在临床上未广泛应用于胎儿血型检测。若是Rh阴性孕妇因其他适应证(如诊断为非整倍体)需要行羊膜穿刺术，可以同时确定胎儿RhD基因型别。羊水检测胎儿RhD阴性时，应通过对母体DNA和羊水源DNA进行单核苷酸多态性相关检测，排除因母体细胞污染导致的假阴性结果。应避免经胎盘羊膜穿刺术及绒毛膜绒毛活检，有引起胎儿流产以及加重的风险。

2.4.2母亲外周血高通量测序确定胎儿Rh血型胎盘合体滋养层含有滋养细胞来源的胎儿细胞核，合体滋养层发生凋亡后可释放大量的凋亡小泡进入母体外周循环，小泡中包含的胎儿有核细胞的DNA片段会随着小泡的溶解、破裂而混入母血中，形成无细胞的胎儿游离DNA(cfDNA)，其携带有RH基因位点，为非侵入性产前诊断胎儿RhD血型提供了理论依据[31]。

目前已推荐进行的检测有RhD外显子4、外显子5和7、外显子4、5和7，或外显子4、5、7和10，且检测时间应为妊娠10周后，因为此时有足够的胎儿细胞游离DNA(cf DNA)，能够达到临床检测标准[9]。如果在母体血浆中检测到这些RhD外显子，表明存在胎儿cfDNA，胎儿为RhD阳性。如果不存在RhD外显子，且可证明所检测到的是胎儿cfDNA而非母体cfDNA，则胎儿为RhD阴性。血浆样本中识别出Y染色体基因序列证实存在胎儿cfDNA，则可验证检测结果。若为女婴，可使用胎儿单核苷酸多态性检测明确样本中是否存在胎儿cfDNA[6]。也有报道将超甲基化RASSF1A启动子作为确定存在胎儿DNA的普遍胎儿标志物[32]。假阳性结果已归因于胎儿携带了遗传自母亲的RhD假基因或其他基因变异[33]。此种情况下，RhD基因10个外显子均存在，但因外显子3、4之间的内含子中含有一个终止密码子而阻断翻译过程，即表现为血清学RhD阴性。使用针对RhD基因外显子4和10的引物进行检测，通常可以检测到RhD假基因。若未发现为假阳性，可能会导致采取不必要的有创性干预措施。若怀疑有RhD假基因存在，cfDNA的检测结果将归为“不确定”，推荐采用羊膜腔穿刺术采集羊水细胞检测胎儿DNA，同时采集父母血液进行实验室分析。

相较于假阳性结果，假阴性结果会更严重，可能因此而停止必要的监测和干预。假阴性结果可由于在妊娠期过早(妊娠<8周)采集母体样本，导致样本中胎儿cfDNA水平较低，或由于实验室检查技术敏感性低。应对一个以上的RhD区域进行检查，以确保阴性结果真实性，且不存在RhD的变异。目前认为cfDNA假阴性率很低，因此cfDNA提示胎儿为RhD阴性时，不会开展连续滴度测定。且分娩后通过脐带血样本直接Coombs试验即可发现假阴性结果。一项对cfDNA用于RhD检测研究的meta分析显示，在妊娠第一和第二阶段，cfDNA检测RhD的敏感性为99.3%(95%CI 98.2～99.7)，特异性为98.4%(95%CI 96.4～99.3)[34]。目前一些国家胎儿RhD分型已经成为产前检查的常规项目[35]。国内也报道了使用MALDi-TOF质谱技术、实时荧光定量PCR技术检测预测胎儿RhD基因型无创产前检测胎儿RhD血型的方法[36-37]。

高通量测序技术可以一次对几十万到几百万条 DNA 分子进行序列测定，也称其为下一代测序技术(NGS)，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序。应用高通量测序技术检测疾病的遗传学特征已经成为当前精准医学的重要组成部分。当面对复杂的疾病，传统的Sanger测序、PCR、DNA 印记杂交等技术已经不能满足临床需求，而NGS技术最大的优势是索取样本量小、成本低，为疾病的遗传学筛查与诊断提供了便捷的途径，在微生物的鉴定、药物的靶向治疗以及产前筛查等多个领域具有潜在的应用优势[38]。

英国是最早将无创胎儿RhD检测技术用于临床的国家，使用的技术包括RT-PCR和目标序列捕获的高通量测序技术。2016年12月英国国家卫生与临床优化研究所(NICE)发布胎儿RhD基因型高通量无创产前检测指南[39]，指出8项欧洲国家前瞻性研究报道高通量NIPT对胎儿RhD基因型的诊断准确性，其中6项研究被认为是低偏倚风险，广泛适用于在英国全国范围内使用高通量NIPT检测胎儿RhD基因型。

如果胎儿是Rh阴性，母亲没有额外的红细胞抗体，则不会有胎儿和新生儿溶血性疾病的风险，无需进一步监测母体或胎儿溶血。使抗-D免疫球蛋白的应用更具有针对性，可将不必要的抗-D免疫球蛋白注射降低至2%。如果胎儿是Rh阳性，则需要监测间接Coombs滴度，达到临界滴度后监测MCA-PSV。如果胎儿是Rh阴性，但母亲有额外的抗体(如抗c或抗e)，也需要监测胎儿溶血及母亲间接Coombs滴度和MCA-PSV。通过高通量测序技术进行胎儿Rh血型检测，指导Rh阴性孕妇孕期管理，对于存在母儿血型不合风险者加强管理，应用预防性治疗。对于不存在母儿血型不合的情况也可立即确诊，避免不必要的动态观察及预防性治疗，消除孕妇的精神负担与经济损失。

3 母儿Rh血型不合的治疗

若孕期监测MCA-PSV>1.5MoMs,可以通过脐血穿刺获得胎儿血液测定血红蛋白，若胎儿血红蛋白低于平均值两个标准差以上，则需宫内胎儿输血治疗。红细胞压积<30%也可作为胎儿输血的阈值[40]。如果血红蛋白高于这个阈值，应1～2周内再次检测。输血前应检查胎儿血红蛋白水平，因为较高的MCA-PSV并不能作为临床显著胎儿贫血的确切证据，可能会出现假阳性情况[21-22]。血红蛋白水平降低时适当输血比等到发生严重贫血(血红蛋白缺乏症:比正常胎龄低7g/dl[16])或水肿(血红蛋白<5g/dl)[21]时，胎儿预后更好。

宫内输血一般仅限于妊娠18～35周的孕妇，因为在18周之前，胎儿解剖结构较小，对操作技术挑战极大。对于有既往妊娠受累史且极早发生重度同种异体免疫的罕见患者而言，可在妊娠20周前进行胎儿宫内输血，但该做法在水肿胎儿中的成功率较低。

美国血浆置换学会关于使用治疗性血浆分离置换的指南中提出，宫内输血是目前的主要治疗方法，而血浆置换和静脉用IgG可以使胎儿血细胞比容维持在高于危及生命的水平，且维持时间长，从而可维持到在技术上可实现宫内血管内输血的胎龄。如果妊娠20周前有胎儿死亡的高风险或胎儿水肿的征象，可能需要进行IVIG和/或治疗性血浆置换[41]。

随着宫内输血的应用，严重胎儿贫血引起的围产期死亡率已下降至 10%以下[42]。出生后新生儿溶血病的治疗主要以光疗和换血疗法为主，以预防高胆红素血症引起的核黄疸。其他近期并发症还包括新生儿贫血，血小板减少，胆汁淤积和呼吸系统疾病。多次进行宫内输血的新生儿在出生后往往缺乏网织红细胞，因输入血的红细胞主要含成人型血红蛋白。所以，这些新生儿又会出现贫血，需要在出生后的几周内追加输血。

4 分娩时机及围术期准备

妊娠35周之后，宫内输血被认为比产后输血治疗更危险[43]。因此，在妊娠≥35周，MCA-PSV>1.50MoMs时，可以选择终止妊娠。但目前缺乏关于有贫血风险胎儿或因贫血接受宫内治疗胎儿分娩最佳时机的高质量研究。一方面需要权衡死胎、胎儿贫血后果和再次采血或宫内输血等风险，同时预防早产引起的未成熟儿、贫血加重和高胆红素血症，专家建议孕37～38孕周计划分娩[42]。因此，大多数临床医生进行最后一次胎儿采血和输血的时间不晚于孕34～35周。

分娩无贫血或轻中度贫血的胎儿是母儿血型不合临床管理的目标。分娩前应充分做好准备，选择分娩方式，积极联系新生儿科，血库等。分娩时新生儿科的尽早介入，做好输血准备，若无法经阴道分娩应行剖宫产术终止妊娠。