规模化鹅场致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性检测

张瑀琪，苏玉铭，王芷晴，刘海月，李欣南，于丽玲，李 宁，戴成杰，李 冰，周铁忠，刘英姿*

（1.锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁锦州 121001；2.大石桥市农业农村事务中心，辽宁大石桥 115100；3.辽宁省检验检测认证中心，辽宁沈阳 110032；4.瓦房店市动物疫病防控中心，辽宁大连 116300；5.辽宁省农业发展服务中心，辽宁沈阳 110032；6.朝阳县畜牧技术推广站，辽宁朝阳 122000）

鹅大肠杆菌病是由大肠埃希菌（Escherichia coil）致病菌株引起的临床常见鹅细菌病之一,主要表现局部或全身症状，不同日龄不同型病例表现不同，常见有孵化中死胚、卵黄性腹膜炎、败血症等，由垂直传播或经消化道、呼吸道等多种渠道感染，一年四季均可发生[1]。近年来，养鹅业发展迅速，养殖密度提高，鹅大肠杆菌病发病率及死亡率逐年上升。因抗生素的滥用，鹅大肠杆菌的耐药性不断增强，为临床治疗带来困难，造成养殖户经济损失[2]。本试验以辽宁省黑山县某发病鹅场作为研究对象，进行鹅致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析，为鹅大肠杆菌病的诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2020年7月10日辽宁省黑山县某鹅场15日龄雏鹅及180 日龄雌鹅发病。该场饲有东北小白鹅6 000 只。雏鹅发病率35%，死亡率29%。雏鹅表现精神沉郁、排灰白色稀粪、眼结膜潮红、头面部肿胀；剖检可见腹水、气囊混浊、包心包肝、多脏器粘连等。产蛋鹅产蛋率下降50%，表现厌食、精神沉郁；剖检可见卵黄性腹膜炎。选取具有典型症状病鹅4 只，无菌采集8 份病料，冷藏箱保存，24 h 内送至实验室检测。

1.2 试剂及动物

试剂：微量生化反应管（杭州天和微生物试剂有限公司）、细菌基因组DNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司）

动物：20日龄体重（20±2）g SPF级昆明小鼠50只，购自锦州医科大学实验动物中心。

1.3 试验方法

1.3.1 病原菌的分离培养、纯化及镜检

无菌条件下，将病料接种于麦康凯琼脂培养基，挑取优势菌落，再次接种麦康凯琼脂培养基纯化培养。革兰氏染色阴性短小杆菌的纯菌落接种于普通营养琼脂培养基培养，挑取适量单菌落于磁珠冻存管冻存。

1.3.2 生化试验

取普通营养琼脂培养基上的疑似菌落接种于微量生化反应管，37 ℃培养24 h，观察并记录试验结果。

1.3.3 血清学鉴定

这时的常爱兰什么也听不进去，但打孩子的动作总算是停了，驮子么在一边不停地叹着气，唉，真丢人真丢人。他拿过一张又一张桌上的纸，直看得面红耳赤，这种面红耳赤就跟老樟树下周大毛他们取笑他时一模一样。

将分离菌株培养物用2 mL 0.5%石炭酸生理盐水冲洗制成菌悬液，121 ℃高压1 h破坏抗原。将高压抗原与单因子血清做平板凝集试验，观察结果。

1.3.4 分子生物学检测

按细菌基因组DNA提取试剂盒说明书步骤提取分离菌的基因组DNA作为后续PCR反应模板，使用16S rRNA通用引物扩增，目的片段为1 450 bp。PCR 反应体系见表1。PCR 扩增程序：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30 个循环；72 ℃延伸10 min。电泳，使用胶收试剂盒回收目的条带测序，利用NCBI数据库比对结果并分析。

表1 PCR反应体系Tab.1 PCR reaction system

1.3.5 致病性试验

1.3.5.1 菌液的制备

将分离株于肉汤培养基复苏。用无菌PBS 溶液洗涤3次后，每管加入500 μL无菌PBS溶液制成菌悬液备用。

1.3.5.2 小鼠致病性试验

表2 小鼠分组及处理方法Tab.2 Group and treatment methods of mice

1.3.6 药敏试验

参考《2019 年动物源细菌耐药性监测计划》附件6，选取14 种抗生素进行试验。根据美国临床和实验室标准（CLSI）的标准，采用微量肉汤稀释法进行药敏试验，观察并记录结果。

2 结果与分析

2.1 菌株分离培养结果（见图1～图4）

8份病料样品，均有菌落生长。由图1～图4可知，分离株在普通琼脂培养基为圆润半透明灰白色菌落；在麦康凯培养基上为边缘整齐的中等大小湿润粉红色菌落；在伊红美兰琼脂培养基形成黑色或黑紫色有明显金属光泽中等大小菌落。经革兰氏染色镜检可见，G-，单个存在短小杆菌。以上特征符合大肠杆菌形态特征。

图1 普通琼脂培养基培养结果Fig.1 Training result of common agar medium

2.2 菌株生化试验结果（见表3）

由表3可知，选取8株分离株进行生化鉴定，结果与大肠杆菌生化特点相符。

2.3 菌株血清学鉴定结果

对分离菌株进行血清型鉴定，其中O883 株、O1712 株、O592株、O271株。

图2 麦康凯培养基培养结果Fig.2 Training result of McConkey medium

图3 伊红美蓝培养基培养结果Fig.3 Training result of eosin methylene blue medium

图4 大肠杆菌革兰氏染色特征Fig.4 Gram staining characteristics of Escherichia coli

表3 菌株生化试验结果Tab.3 Biochemical test results of strain

2.4 菌株分子生物学鉴定结果（见图5）

由图5可知，经PCR扩增及凝胶电泳，得到1 450 bp目的条带，序列经NCBI 中Blast 在线比对，与大肠杆菌的同源性高于99%，确定其为大肠杆菌。

2.5 小鼠致病性试验结果（见表4、图6～图8）

由表4可知，各血清型选取1株代表菌株，进行小鼠致病性试验，4 组感染组小鼠发病率为92.5%，死亡率为87.5%，细菌学检查阳性率均为100%。

由图6、图7可知，发病小鼠精神沉郁、腹部膨胀、口鼻发绀。由图8可知，剖检可见腹腔有纤维素渗出、肝脏肿大有瘀血斑、表面附着纤维素伪膜、脾脏暗红肿大、心外膜出血、肾脏肿大有出血点。

2.6 药敏试验结果（见表5）

各血清型选取1株代表菌株，进行14种药物敏感性试验。由表5 可知，本次选取的4 株致病性大肠杆菌对甲氧苄啶、磺胺异恶唑敏感，对黏杆菌素、美罗塔南、氧氟沙星、恩诺沙星、头孢他啶、头孢噻呋、氟苯尼考、四环素、大观霉素、庆大霉素、氨苄西林耐药。

图5 16S rRNA PCR鉴定结果Fig.5 16S rRNA PCR results

图6 发病小鼠精神沉郁、口鼻发绀Fig.6 Depression and cyanosis of mouth and nose in mice

图7 病死小鼠腹部膨胀Fig.7 Abdominal distention in dead mice

表4 小鼠致病性试验结果Tab.4 Results of pathogenicity test in mice

图8 小鼠剖检变化Fig.8 The changes of mice autopsy

3 讨论

鹅大肠杆菌病病型复杂多变，常见有死胚、败血症、卵黄性腹膜炎、脑膜炎等[3]。本研究对辽宁省黑山县某大型发病鹅场进行病例观察和病原菌分离鉴定，确认为鹅大肠杆菌病。雏鹅主要表现为浆液纤维素性浆膜炎，成年鹅为卵黄性腹膜炎。此前，东北地区已有多个鹅场出现鹅致病性大肠杆菌感染发病，证明本病发生普遍、危害严重[4-7]。

大肠杆菌血清型众多且不同血清型间交叉保护力低，所以需对当地优势血清型进行检测，并结合相应血清型疫苗预防才能达到理想效果[8]。赵阳[9]于黑龙江省分离的鹅致病性大肠杆菌血清型为：O9、O18、O64、O93。本研究分离的黑山地区鹅致病性大肠杆菌血清型为：O88、O171、O59、O27，证明不同地区大肠杆菌血清型具有差异。小鼠致病性试验证明：O171致病性最强，死亡率高达100%，其他血清型也具有较强致病性。

表5 药敏试验结果Tab.5 Results of drug sensitivity

2017 年，王春莲等[10]关于承德地区鹅致病性大肠杆菌的研究中，分离株对四环素、复方新诺明的耐药率也高达100%。本研究中的药敏试验结果表明，黑山地区分离株对黏杆菌素、美罗塔南等11 种抗生素严重耐药。各地区鹅致病性大肠杆菌已产生较强耐药性且有地区差异[11-13]。因此，科学应用敏感药物对鹅大肠杆菌病进行防治才能达到理想效果。

4 结论

从辽宁省黑山县某发病鹅场分离鉴定4 种血清型大肠杆菌，分别为O88、O171、O59、O27。所分离的鹅大肠杆菌是有较强致病性和耐药性，建议选取敏感药物甲氧苄啶、磺胺异恶唑对鹅大肠杆菌病进行防治或开发相应血清型疫苗进行免疫防控。