冷冻双束扫描电镜的开放与管理

李晓敏

(清华大学 生命科学学院，北京 100084)

清华大学仪器设备采用先进的全生命周期管理模式[1]，本文涉及的大型仪器带冷冻传输系统的双束扫描电镜，正是处于该管理模式下. 该仪器自采购、到货安装以来，在科学高效的管理模式下，已成为包括生命、医学、食品、化学、材料等多个学科研究的重要辅助手段之一. 该仪器不仅可观察处于溶液、凝胶状态样品在原生态的形貌，还可进行样品的精细聚焦离子束加工，尤其是应用聚焦离子束技术制备的细胞或组织样品的冷冻超薄切片，可与冷冻透射电子显微学结合，实现原位生物大分子高分辨结构的解析，这也是目前国际相关研究领域的前沿发展技术. 总之，该类型仪器可实现多种技术功能，系统配备选择多样化，目前商业化的仪器包括Thermo Fisher Scientific(赛默飞，原FEI)、HITACHI(日立)、ZEISS(蔡司)、TESCAN等厂家的双束扫描电镜，配套的冷冻传输系统可选择英国Quorum和德国Leica等公司产品，Thermo Fisher Scientific近年推出一体式冷冻聚焦离子束显微镜Aquilos系列. 前些年我校安装使用的仪器多为分体式的模式，电镜主体和冷冻传输系统分属不同的厂家，虽然在仪器使用和维护方面积累了一定经验，但存在兼容性问题. 近两年我校新购置了一体式仪器，兼容性强，仪器的使用和维护方面还需进一步摸索.

总之，探究带冷冻传输系统双束扫描电镜的开放与维护机制，总结仪器故障类型与起因，对于实现仪器共享[2-3]，提高同类仪器的管理效率[4-5]，具有较为重要的意义[6]. 本文将以开放共享使用4年的分体式冷冻双束扫描电镜为例，介绍包括开放管理模式与成效、仪器故障与维护等相关内容.

1 仪器的基本配置

Thermo Fisher Scientific公司生产的型号为Helios NanoLab G3 UC的双束扫描电镜，在配置方面较为全面，包括场发射扫描电子束和离子束. 其中电子束部分配有elstar 电子枪，为Schottky热量场发射器，灯丝寿命可用3年. 离子束为Tomahawk Ga离子枪，每支离子源寿命可使用1 000 h. 在图像信号采集方面，扫描电子显微成像配备多种探头，适用于不同的样品和工作模式：(1)Everhart-Thornley Detector(ETD)和Through Lens Detector(TLD)，可分别探测最高采集效率的二次电子(Secondary Electrons，SE)和背散射电子(Backscatter Electrons，BSE). (2)In Column Detector(ICD )可更高效率地探测BSE，适用于低电压. (3)可伸缩的背散射电子探头(DBS)，适用于高电压、原子序数大的样品. (4)可伸缩的STEM探头，观察透射样品. (5)配合减速模式(Beam Deceleration，BD)使用的Mirror Detector(MD)探头，位于物镜镜筒中. 离子束成像时也配备ETD、TLD和ICE(in Chamber Electron & ion detector)多个探头. 另外，该仪器还配备有Pt气体沉积源(GIS Injection)、放电中和(Charge Neutralizer)、等离子清洗(Plasma cleaner)和切片提取控制系统(Easylift)等. 除上述电镜的基本配置外，该仪器同时还配备冷冻传输设备：英国Quorum PP3010T，如图1(b)所示. 其包括电脑控制系统、液氮雪泥制备舱、样品制备舱室、样品传输杆、抽真空和气流管路、电镜舱室内配套的冷冻样品台等，可实现样品的快速冷冻、断裂、升华、溅射镀膜以及样品传输等一系列应用. 该系统为带有涡轮分子泵的高真空系统，样品制备腔室的真空度可与扫描电镜冷冻状态下的高真空相匹配，有效避免电镜舱室的污染.

图1 带冷冻系统的双束扫描电镜配置(a) 双束扫描电镜Thermo Fisher Scientific Helios Nano Lab G3 UC, (b) 冷冻传输系统Quorum PP3010T各部分组成Fig. 1 Dual beam (SEM/FIB) electron microscope with cryo-preparation system(a) dual beam (SEM/FIB) electron microscope Thermo Fisher Scientific Helios Nano Lab G3 UC, (b) component parts of cryo-preparation system Quorum PP3010T

2 仪器开放共享与成效

2. 1 仪器开放服务内容与权限

本仪器目前面向校内外用户广泛开放共享，开放测试服务的内容包括：(1)实现生物样品在大尺度范围自动化连续切片并扫描成像(Serial Block Face Imaging)[如图2(a)所示]，实现亚细胞水平的高分辨率三维数据采集和重构[7]. (2)与PP3010T冷冻传输系统配套使用，除可以实现生物、食品、材料等样品原生态下表面或者断面的精细形貌、结构等[如图2(b)所示]的观察和分析外，更重要的是能够实现细胞、晶体等样品在冷冻条件下原位切割减薄[如图2(c)所示]，制备100～200 nm厚度的薄片(lamella)，以进行高分辨冷冻透射电镜数据的采集和分析[8-9]. (3)常温生物样品和其他材料表面精细形貌和超微结构的观察和分析，可实现样品大尺度图像的采集和拼接[如图2(d)所示]，可实现与荧光显微镜(常温和冷冻状态成像)之间的有效关联.

图2 带冷冻系统的双束扫描电镜可实现的几种功能(a) 常温SEM/FIB，常温包埋块样品自动化连续切片并扫描成像的图像代表，线虫头部内部结构, (b) 冷冻SEM，乳液样品的冷冻扫描电镜观察, (c) 冷冻SEM/FIB，冷冻含水载网样品的聚焦离子束减薄技术应用，大图是减薄后的冷冻扫描电镜低倍成像，右上角是减薄后的冷冻聚焦离子束成像, (d) 常温扫描电镜图像的大图拼接(应用Maps软件 )Fig. 2 Several functions of dual beam (SEM/FIB) electron microscope with cryo-preparation system(a) SEM/FIB at room temperature. Serial block face imaging for the embedding resin block sample. The image is the section of C. elegans head. (b) cryo-SEM. The cryo-SEM imaging of the emulsion sample. (c) cryo SEM/FIB. The application of cryo-FIB milling for the vitrified sample on the grid. The large picture is cryo-SEM image at low magnification after milling, the inset is cryo-FIB image after milling. (d) montage of SEM images at room temperature (with Maps software)

在仪器的操作权限方面，实行分级设置：(1)普通用户可在经过简单培训之后，进行样品台移动、调焦、拍照等基本操作. (2)中级用户可在普通用户操作基础上，进行常温状态真空舱室的放气、更换常温样品以及样品台的安装等操作. (3)高级用户可在中级用户操作基础上，进行冷冻系统的准备，冷冻样品的装载与传输，GIS Pt保护层喷镀、离子束减薄相关操作.

对于有较多测试需求的用户，我们一般推荐其经过培训与考核两个过程后，获得对应的操作权限等级. 中级和高级用户可在任意时间段自行预约机时，进行常温样品的测试. 仅高级用户可在任何时间段自行预约机时，进行冷冻样品相关的测试项目. 对于测试需求较少的用户，可不必获取操作权限等级，但无自主预约机时权限，需要提前同仪器管理员协商合适的测试时间，由管理员辅助进行测试项目.

另外，由于本仪器在进行离子束减薄应用时，需耗费较长的机时，一般在正常的工作时段内无法完成所有测试工作. 针对这种情况，除了培训常用用户通过高级操作考核之外，我们还培训了具备高级操作权限的学生助管，可在非工作时段协助用户，完成冷冻离子束减薄后的样品传输与回收. 通过上述分级开放的管理形式[10]，既减少了仪器故障率，又延长了仪器有效测试机时，从而有效提高了仪器的运维效率[11-12]. 同时，分级开放实验的工作模式，也提高了学生的实践能力[13]，进一步加深学生对仪器工作原理的理解，为本仪器在科研应用方面的拓展和功能开发奠定基础.

2. 2 仪器开放共享成效

随着仪器测试服务项目的完善和开放共享的实行，有效使用机时基本逐年增加，共享服务范围和比例呈现扩大趋势. 以2017年和2018年清华大学冷冻双束扫描电镜的机时开放年时数为例[如图3(a)所示]，2017年的有效使用机时为1 612 h，常温SEM成像、常温FIB应用、冷冻SEM成像、冷冻FIB应用4种不同的测试项目所占比例分别为9%、50%、20%、21%. 2018年的有效使用机时为3 073 h，上述比例分别为2%、21%、18%、59%. 与2017年相比，2018年的开放年时数提高近一倍. 2017年测试项目中，常温FIB(常温包埋块样品的连续切片并扫描成像)为该仪器的主要应用功能，测试机时占50%. 而自2017年末起，仪器管理人员针对冷冻FIB(冷冻含水样品的原位减薄)技术进行了方法学开发与探索应用，该测试项目在2018年和2019年总机时中占比分别为59%和72%，成为仪器的主要应用功能. 与2018年相比，2019年的总机时略有下降，共约2 700 h，原因可能在于：其一，冷冻FIB机时占比提高， 冷冻FIB应用每天均需要进行较长时间的回温，以保持较好的真空状态，该回温过程未计入有效机时. 其二，可连续工作的应用项目—常温FIB相对机时占比降低.

图3 双束扫描电镜Helios的开放测试机时分析(a) 2017～2019年双束扫描电镜开放年时数对比,包括常温SEM成像、常温FIB应用、冷冻SEM成像、冷冻FIB应用4种不同的测试项目, (b) 2017～2019年双束扫描电镜开放比例,包括校内测试机时和校外测试机时Fig. 3 Analysis of opening times for dual beam (SEM/FIB) electron microscope(a)the comparison of opening times for dual beam (SEM/FIB) electron microscope, within the years of 2017, 2018 and 2019, including SEM imaging at room temperature, FIB application at room temperature, cryo-SEM imaging, cryo-FIB application. (b) the opening percentage of dual beam (SEM/FIB) electron microscope, within the years of 2017, 2018 and 2019, including the internal and external opening times

本文讨论的仪器测试用户范围从零基础开始逐渐发展扩大. 从图3(b)可以看出，在2017年和2018年对外服务比例较低，校外测试机时比例分别为10%和3%，服务用户范围有限. 而到 2019年，校外测试机时比例有较大改变，比例提高至20%，并且测试用户的范围也有所扩大. 目前校外测试用户不仅包括北京地区的科研院所和高校，而且有较多来自其他地区科研单位的广大用户. 校外用户的测试项目主要集中在冷冻SEM观察(比如乳液等样品的冷冻扫描电镜分析)和常温FIB应用(常温包埋块样品的连续切片并扫描成像)，其中冷冻SEM在2017、2018、2019年度校外测试机时中占比分别为62.8%、40.4%、57.6%，常温FIB应用在上述两年年校外测试机时中占比分别为0%、27.7%、41.6%. 从上述数据中分析可以看出，常温FIB应用测试的机时比例稳中有升，这在一定程度上反映出用户对本仪器相关性能的认可和仪器对外服务的功能拓展.

总之，该仪器开放成效显著，测试应用的全面化和共享服务的优质化，促使仪器影响范围逐渐扩大，开放效率逐步提高. 自开放共享以来，依托本文讨论的仪器，支撑科研项目30余项，发表论文近20篇，涉及领域包括生物、食品、机械、航空航天、化学、材料等，论文刊登在包括Cell Research、PNAS、Angew Chem Int Ed、Food Hydrocolloids等影响力较大的期刊上.

3 仪器常见故障及解决方案

由于本台双束扫描电镜组成较为复杂，包括扫描电子束、聚焦离子束部分(ThermoFisher Scientific 公司)以及冷冻传输系统(Quorum公司)，因此将对这三部分的常见故障及排除方法分别阐述.

3. 1 电子束及电镜主体常见故障

3. 1. 1 电子束FEG场发射灯丝故障

本台仪器配备的是场发射UC灯丝，一般具有3～5年寿命. 在平时的维护过程中，可通过观察灯丝的发射电流值大致判断其寿命是否到极限. UC灯丝发射电流值的正常范围是80～150 μA，一旦接近寿命极限，该电流值会在一段时间内逐渐变小，当小于20 μA时，电子束将彻底无法成像. 因此，在检查到灯丝发射电流值低于正常范围并逐步减小时，应及时联系厂家维修工程师，提前安排灯丝的订货和更换事宜. 另外，UC灯丝的储存条件要求比较高，到货后须尽早安装. 灯丝更换时，需要进行烘烤，整个更换过程一般需要3天时间.

3. 1. 2 电子束物镜极靴污染

本仪器配备的离子束进行样品加工时会产生碎屑等，同时冷冻传输系统的应用也容易引入污染，因此电子束物镜极靴被污染的概率较高. 一旦物镜极靴被污染，导致后果最明显的是扫描电子束成像时象散不稳定，这将给连续切片并扫描成像过程的自动化运行带来极大挑战，这需要不定时地进行象散的消除，以保证成像质量. 在物镜极靴污染较为严重，通过软件或控制面板等无法实现象散的校正的情况将导致不能正常成像.

如果出现上述污染情况，需联系厂家工程师对物镜部分进行清理. 在一般情况下，初次清理后效果较为明显，可维持一段时间内的扫描电子束成像效果稳定. 如果污染非常严重，清理后成像效果改善不明显，则需要更换电子束部分的物镜，一般价格较为昂贵. 因此，在日常的使用和维护时，要格外注意避免污染的发生. 本文将在后续仪器的维护部分介绍相关注意事项.

3. 1. 3 循环水系统故障

电镜配备了冷却循环水机(现在常用的是风冷式)，一旦该机器出现故障，或者所处房间空调故障等，都有可能引起水温异常(常见的是水温升高)，某些型号的循环水机会自动报警. 同时电镜的电脑界面会提示“lens off”等信息，电镜将无法正常使用. 出现上述故障时，应立即对电镜真空舱室放气，停止分子泵的运转. 在排查时，一般需要首先检查循环水机所处房间的空调制冷是否正常，再检查循环水机的水位. 排除上述因素后，最简单的处理办法是先尝试关闭电源，待水温自然下降后，再开启机器进行重置，观察水温能否下降，一般正常工作水温在18～20 ℃范围内. 另外，如果配备的是水冷式循环水机，则要注意观察室外机是否有灰尘、飞絮等引起水循环回路堵塞的情况. 总之，循环水系统故障是电镜维护过程中最常发生的故障之一，因此在日常的维护中需要定期做好故障隐患的排查.

3. 1. 4 电路板或其他元件故障

在扫描电子束成像部分的使用和维护过程中，还可能出现由于电路板或其他元件故障引起的报错[14]，一般更换对应的部件后，即可排除故障. 比如本文介绍的仪器发生过以下几种故障：电子束光阑位置感应头故障，导致无法更换电子束的束流. 成像探头的高压板故障，引起成像不正常. 真空系统故障，导致真空状态不能维持，从而无法成像等.

3. 2 离子束部分常见故障

3. 2. 1 离子束无法维持长时间加热状态

离子束的使用与维护中最需要注意的是离子束加热维持时长的问题. 应用聚焦离子束进行常温或冷冻含水样品的加工减薄时，需要离子束维持较长时间的加热状态. 尤其是在常温包埋块样品连续切片并扫描成像技术应用的过程中，一旦离子束由于加热时长不足导致不能继续工作，将无法保证切片数据的连续性.

如果在使用过程出现离子束加热中断的状况，在排除真空系统故障和离子源使用寿命极限的因素后(一般每支离子源的使用寿命在1 000 h左右)，首先可尝试直接加热离子源(在UI界面点击“Beam on”或者“wake up”). 如果不成功，则进入service模式，在离子枪应用控制系统中(I Gun)，先将离子源置为“IDLE”状态，再进行“HEAT”. 若仍不成功，则可尝试对离子枪应用控制系统进行硬件重启或者对电镜系统进行“standby”，重启后再尝试“HEAT”(此处需要注意的是，如果该故障发生在应用Quorum PP3010T冷冻传输系统进行样品加工试验的过程中，则不能直接进行standby，原因是冷冻条件下该系统冷台无法进行大幅度旋转，而进行电镜standby后样品台需要进行旋转和平移以完成“home”过程). 假设上述方法均不成功，则需要联系厂家维修工程师. 在相关的硬件更换方面，可能包括更换新的离子源、更换离子枪真空系统、更换离子枪控制柜、更换source end乃至整个离子枪部分.

3. 2. 2 电路板或其他元件故障

与电子枪部分类似，在离子枪的使用和维护过程中，也可能出现由于电路板或其他元件引起的故障，一般更换对应部件后也可排除.

3. 3 冷冻传输系统常见故障

3. 3. 1 冷冻系统气体管路结冰堵塞的问题

对于带冷冻传输系统的双束扫描电镜，气体管路结冰后会导致气流不畅、管路堵塞，冷台和冷阱的温度将由于气流不足而持续上升. 目前Quorum的PP3010T冷冻传输系统、Thermo Fisher Scientific 的Aquilos冷冻双束扫描电镜系统均可能出现如上问题. 尤其是在多雨季节，环境空气湿度较大，冷冻系统在使用过程中出现气流管路结冰堵塞的情况较为频繁. 另外，由于所需要的氮气量较大，而在国内的实验室一般没有配备专门的供气管道，用于提供氮气气流的是自增压式液氮罐(或中压液氮罐)，因此当液氮中的含水量较高时更容易出现管路结冰的情况. 值得注意的是，一旦出现如上问题，将无法继续进行冷冻样品的加工减薄和观察实验，必须立即回收样品，避免因升温过高导致样品损毁.

为了尽可能避免在使用过程中出现气流管路堵塞的问题，一方面尽量选择含水量低的液氮供应厂家，另一方面可在自增压液氮罐出气口的后方连接干燥装置，进一步降低氮气中的含水量. 再有，在外界环境湿度大时加开除湿装置，可有效控制环境的湿度.

3. 3. 2 冷台温度不足的问题

应用聚焦离子束对冷冻含水的生物样品(细胞、组织等)进行减薄加工，原位制备100～200 nm的冷冻超薄切片是带冷冻传输系统双束扫描电镜最为重要的功能应用之一. 而要制备加工理想的冷冻超薄切片，最为重要的因素是保证所处冷台的温度足够低，并且样品夹载梭与冷台的接触良好、导温效果佳，从而保证样品在加工过程中维持足够低的温度. 一般而言，冷冻系统所带的温度传感器位于冷台位置，而样品夹载梭与冷台是通过紧密接触进行温度传导的. 因此，温度传感器的显示值并不代表样品在电镜舱室内的真实维持温度. 在仪器维护时需要定期检查样品夹载梭和冷台之间的接触性，并用测温台监测样品夹载梭的实际温度. 对于本文讨论的仪器，经过测试发现在最大气流下，降温40 min后，样品夹载梭上的真实温度能够达到最低，约-160 ℃左右. 假设样品维持温度不足，随着在电镜舱室内停留时间的延长，样品会出现不同程度的脱水现象，在加工过程中可能会观察到样品薄片弯折现象，严重时可以看到失水后细胞结构之间的空隙.

3. 3. 3 其他硬件故障

其他可能出现的故障包括：真空泵故障、管路漏气、电镜舱室与冷冻系统样品制备舱室之间的连通阀门故障等.

4 仪器维护的注意事项

在双束扫描电镜的维护方面，主要包括以下几个方面：(1)定期添加循环水(专门的补充液或者超纯水等)，保证循环水的液位. (2)电镜舱室放气破真空时，通入高纯氮气，避免杂质的引入. (3)保持仪器房间的洁净，定期清理电镜舱室，可用无纺布蘸取少量酒精擦拭舱室内部，也可用电镜配备的等离子清洗仪(plasma cleaner)对舱室内部或样品进行清洁. (4)严格把控送入电镜舱室内的样品特性，保证样品无磁性、无毒性、无挥发性，尽量避免观察含油的样品，常温样品要保证必须经过干燥处理，并且在进入电镜舱室前用气体喷枪反复吹扫确保洁净. (5)定期进行电子束和离子束的合轴. (6)离子源、拔出极、抑制极、离子束光阑、GIS Pt源都属于耗材，需定期更换，离子源的使用寿命为1 000 h左右，每个离子源更换的同时需更换拔出极，每更换2～3个离子源需要更换一次离子束光阑(根据具体使用情况而定)，每更换3个离子源需更换一次抑制极，Pt源使用寿命为100 h，消耗较为缓慢，一般可使用5年以上.

在冷冻传输系统的维护方面，需要对样品传输杆进行定期的保养，对各种样品梭进行清洗. 样品制备舱室的导电层溅射靶材也属于耗材，但一般消耗较慢. 进行冷冻样品的断裂时，在样品制备舱室内会积累断裂下来的杂质，为避免样品传输时将杂质带入电镜舱室污染物镜，也需定期对样品制备舱室进行清理.

如果提前接到停电通知，在仪器配有UPS不间断电源的前提下，将冷冻传输系统关机，并将电镜舱室放气以停掉分子泵，将电镜转入standby状态，控制电脑关机. 来电后，先将循环水、空调依次开启后，再将电镜开机即可. 另外，为保证电镜系统的运行流畅，日常维护时每间隔半个月可进行一次电镜的standby和重启，以及控制电脑的重启.

5 结语

带冷冻系统的双束扫描电镜是目前科研工作中非常重要的大型精密仪器，仪器实现科学管理水平将直接影响科研的进度和发展水平[15-16]，这既包括日常维护与故障排除，也包括仪器的开放共享效率. 本文以Thermo Fisher Scientific 公司的Helios NanoLab G3 UC为例，重点介绍了仪器的开放预约与共享成效、故障排除与日常维护等方面的内容，为同类型仪器的高效有序管理提供参考，从而保障相关科研工作的顺利进行.