超声萃取-高效液相色谱法检测塑料玩具中双酚A及其类似物

姜士磊，张璐燕，项 伟，陈 挺，童耀斌，杨兰花

(1. 义乌市检验检疫科学技术研究院，浙江 义乌 322000;2. 浙江壹晟检测技术有限公司，浙江 义乌 322000)

双酚A(BPA)是世界上使用最广泛的工业化合物之一，用于环氧树脂和聚碳酸酯等高分子材料的生产，也用于橡胶防老剂、增塑剂、阻燃剂、农药和涂料等化学产品的生产[1-2]. 双酚A同时又是一种常见的酚类环境雌激素，这类物质在环境中难降解，易在生物体内蓄积，具有生殖毒性[3-4]、神经毒性、免疫毒性等，可导致发育异常[5]，并可引发乳腺癌[6]. 常见的双酚A类似物有双酚B、双酚F、双酚S、双酚AF、四氯双酚A、四溴双酚A等，与双酚A具有类似结构，因此也具有相同的毒性[7]. 作为双酚A的替代品，双酚A类似物也被广泛应用到各个领域.

目前，双酚A的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[8-9]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[10-11]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)[12-13]、紫外分光光度法[14]及其他方法[15]. 文献报道的玩具中双酚A及其类似物的检测主要针对双酚A，其他类似物的检测报道的较少[16]. 本文采用超声萃取-高效液相色谱法，建立了玩具中7种双酚A及其类似物的检测方法，为应对欧美玩具中双酚A及其类似物的管控提供了检测方法.

1 试验部分

1. 1 仪器和试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪，配DAD检测器(美国安捷伦公司)；色谱柱：C18柱，5 μm，4.6 mm×250 mm(美国安捷伦公司)；AL204-1C型电子天平(分辨率为0.1 mg，瑞士梅特勒公司)；D-78224型超声波清洗器(德国Elma公司)；0.45 μm有机系样品滤膜；恒温水浴振荡器(SHA-Z)；可调式氮吹仪(OA-SYS)；旋转蒸发仪(BUCHI)；离心机(Sigma 3-30K).

标准品：双酚A(Dr. Ehrenstorfer，G163551)，双酚B(Dr. Ehrenstorfer，40416)，双酚S(Dr. Ehrenstorfer，170037)，双酚F(Dr. Ehrenstorfer，G975618)，四氯双酚A(上海安谱，FR-022-C)，四溴双酚A(Dr. Ehrenstorfer，G165934)，双酚AF(上海安谱，C10655635).

正己烷、二氯甲烷、四氢呋喃、甲醇均为色谱纯(购自上海安谱)；试验用水为Milli-Q超纯水(Millipore公司). 10批玩具样品均采购自义乌商贸城.

1. 2 HPLC工作条件

C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，DAD检测器，流动相：0～10 min为甲醇-水(体积比60∶40)，10 min后为纯甲醇，流速0.8 mL/min，柱温25 ℃，进样量10 μL，DAD检测器设置：0～3.5 min检测波长262 nm，3.5 min后检测波长为227 nm，峰面积外标法定量.

1. 3 标准溶液的配制

准确称取一定量的7种双酚A类化合物标准品，使用甲醇定容至100 mL容量瓶中，配制成质量浓度为1 000 mg/L的单成分标准储备溶液. 精密吸取一定量的上述双酚A类化合物的标准储备液，使用甲醇稀释并配制成质量浓度分别为0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mg/L的混合标准溶液.

1. 4 样品前处理

称取0.5 g(精确至0.001 g)剪碎的塑料玩具样品，加入20 mL四氢呋喃，40 ℃条件下超声30 min后，加入甲醇40 mL，充分振荡5 min，以5 000 r/min离心10 min. 将离心液转移至圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪浓缩至近干，再用氮吹仪吹干，加入2 mL甲醇定容，过0.45 μm滤膜后，使用HPLC对滤液进行分析.

2 结果与讨论

2. 1 提取条件的选择

目前，用于提取玩具中有毒有害化学物质的方法主要有：振荡提取法、超声提取法、索氏提取法、微波辅助提取法和加速溶剂萃取法等. 与其他提取方式相比，超声提取法具有设备价格低廉、操作简便快速和提取效率高等优点，因此，本文选取超声提取作为双酚A类化合物检测的提取方式.

以含有双酚A的塑料玩具样品为例对提取溶剂进行筛选，提取溶剂分别选择正己烷、四氢呋喃、二氯甲烷和甲醇，提取方法按照前处理方法进行，处理后的样品进行高效液相色谱分析，分析数据如图1所示. 由图1可见，四氢呋喃的提取效果最佳. 这可能是由于塑料在四氢呋喃中具有较好的溶解性，而在其他溶剂中不能完全溶解. 因此，采用四氢呋喃作为双酚A类化合物检测的提取溶剂.

图1 超声提取时间及溶剂对双酚A提取结果Fig. 1 Ultrasonically extracted results of different times and solvents

在其他条件不变的情况下，对超声提取时间进行优化，分别对标准样品提取5、10、20、30、60、120 min，试验发现，超声提取30 min后可充分提取样品中的双酚A类化合物，故选择提取时间为30 min.

2. 2 仪器条件的优化

在210～600 nm之间分别扫描了7种目标化合物的光谱，光谱图显示双酚A、双酚B、双酚F和双酚AF等4种化合物最大吸收波长在227 nm处，双酚S最大吸收波长在262 nm处，四氯双酚A、四溴双酚A在227、288 nm处有吸收. 同时，色谱图还显示，227 nm处的吸收峰高于288 nm处，且峰形尖锐，因此选取227 nm作为四氯双酚A、四溴双酚A的检测波长. 根据各种化合物的出峰时间及最大吸收波长，采用DAD检测器在不同时间设置不同波长的方式进行采集.

在相同的仪器条件下，考察了甲醇-水、乙腈-水作为流动相对多种双酚A类化合物的分离效果，结果表明，甲醇-水作为流动相时，分离效果最佳，峰形尖锐. 考察了甲醇-水不同体积比(60∶40、70∶30、80∶20)作为流动相时，7种双酚A及类似物的分离效果. 结果显示，在等度洗脱的情况下，以甲醇-水(60∶40、70∶30)为流动相时，7种双酚A及类似物的分离效果最好，但是四氯双酚A、四溴双酚A出峰时间较长，分析过程在40 min以上. 以甲醇-水(80∶20)为流动相时，双酚B、双酚AF两种物质无法分离. 根据色谱行为显示，前5种双酚A及类似物均在10 min以内出峰，所以采用梯度洗脱模式，以甲醇-水(60∶40、70∶30)为流动相，10 min后流动相更换为纯甲醇，结果显示，流动相10 min内为甲醇-水(60∶40)，10 min后为纯甲醇时，7种双酚A及类似物分离效果最好，且分析时间能控制在15 min以内. 7种双酚A及类似物的色谱图如图2所示.

图2 7种双酚A及其类似物色谱图(5 mg/L)(1) 双酚S，(2) 双酚F，(3) 双酚A，(4) 双酚B，(5) 双酚AF，(6) 四氯双酚A，(7) 四溴双酚A(从左往右)Fig. 2 HPLC chromatogram of bisphenol A and its analogues (5 mg/L)(1) bisphenol S, (2) bisphenol F, (3) bisphenol A, (4) bisphenol B, (5) bisphenol AF, (6) tetrachlorobis-phenol A, (7) tetrabromobisphenol A(from left to right)

2. 3 线性及方法检出限

按照优化的仪器分析条件进行测试，绘制峰面积-溶液浓度标准曲线，得到各种双酚A类化合物的校准曲线和相关系数. 通过逐步稀释法计算7种双酚A类化合物的检出限. 在空白的玩具样品中，分别添加质量浓度为0.04、0.06、0.08、0.10 mg/L的5种双酚A类化合物(双酚A、双酚B、双酚S、双酚F、双酚AF)及质量浓度为0.12、0.14、0.16、0.18 mg/L的2种双酚A类化合物(四氯双酚A、四溴双酚A)，各水平的样品独立重复检测6次，记录7种双酚A类化合物的峰高、噪声、信噪比等信号. 以3倍信噪比对应的浓度为该化合物的检出限，结合前处理方法换算后样品中各化合物的检出限结果如表1所列.

表1 双酚A及类似化合物的保留时间、线性范围、线性方程、相关系数及检出限Table 1 Retention times, linear ranges, linear equations, correlation coefficients and detections of bisphenol A and its analogues

由表1可知，7种双酚A类化合物的相关系数均大于0.998 8，表明7种化合物在相应的浓度范围内具有线性关系良好. 根据样品的前处理方法，本方法的检出限在0.24～0.72 mg/kg之间，表明具有较高的灵敏度.

2. 4 加标回收与精密度结果

平行称取12份空白样品，6份样品中加入质量浓度为0.5 mg/L的目标化合物，6份样品中加入质量浓度为2 mg/L的目标化合物，按照优化后的条件处理样品，按照最优的仪器条件进行测试，每个浓度测试6次，计算回收率及RSD，结果如表2所列.

由表2可见，7种化合物加标回收率在92.7%～108.7%之间，方法精密度在1.9%～7.1%之间，说明该方法具有较好的准确度，能够满足玩具中双酚A类化合物的分析要求.

表2 塑料玩具中双酚A及类似化合物的加标回收率和相对标准偏差(n=6)Table 2 Standard addition recoveries and relative standard deviations (n=6) of bisphenol A and its analogues

2. 5 样品测定

按照优化后的试验方法，对10批玩具样品(均采购自义乌商贸城)进行分析，结果如表3所列. 由表3可见，序号2、5、7、8的塑料玩具检出双酚A，序号7的玩具检出双酚S，序号9的玩具检出双酚B.

表3 实际样品检测结果Table 3 Test results of real products /(mg/kg)

3 结论

本文建立了一种超声提取-液相色谱法同时检测塑料玩具中7种双酚A及其类似物的方法. 方法检出限为0.24～0.72 mg/kg，相对标准偏差为1.9%～7.1%，说明仪器的灵敏度、精密度良好. 平均回收率为92.7%～108.7 %，说明该方法准确度良好. 该方法简便、快速、准确度高、污染较小，可用于塑料玩具中双酚A及其类似物的检测.