金鲳鱼骨中鱼油的提取工艺及脂肪酸成分分析

于淑池 ，李晨晨，徐云升 ，薛长风 ，裴志胜

1. 海南热带海洋学院食品科学与工程学院（三亚 572022）；2. 海南省海洋食品工程技术研究中心（三亚 572022）；3. 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心（三亚 572022）

金鲳鱼（Trachinotus ovatus）系鲈形目，鲹科，学名卵形鲳鲹，地方名称黄腊鲳、金鲳、黄腊鲹[1]，是海南、广西、广东和福建主要海水养殖品种之一[2]，2016年产量约15万 t[3]，年产值将近100亿元[4]，其体形较大，肉质细嫩，味道鲜美，无肌间刺，是加工鱼块的优良材料[5]；自2005年以来，金鲳鱼的加工制品比例不断升高，占总产量的50%～80%[6]。加工过程中有鱼头、鱼骨、内脏等副产物产生，大多是直接丢弃，这不仅造成资源浪费，还污染环境[7]。实验室前期从金鲳鱼骨中提取明胶时发现[8]，金鲳鱼骨（干质量）中粗脂肪含量非常高（43.75%±0.28%），目前从金鲳鱼骨中提取鱼油的报道鲜见，仅有曹璇等[9]利用超声波辅助稀碱水解法提取了金鲳鱼骨油，采用酶解法提取金鲳鱼骨油还未见报道。因此，此次试验采用环境友好的酶解法提取金鲳鱼骨鱼油，以实现对金鲳鱼加工副产物的高值化利用，同时减少环境污染。

目前鱼油提取方法主要有淡碱水解法、压榨法、有机溶剂法、蒸煮法、低温提油法、酶解法（水酶法）、酸水解法、超临界流体萃取法等[10-11]；酶解法是利用蛋白酶水解破坏蛋白质和脂肪之间的结合释放油脂[12]，具有作用温和、时间短的特点，且有效保护油脂组分，能够充分释放原料中的油脂，从而提高鱼油品质和鱼油提取率[13]，蛋白酶水解生产的酶溶液可进一步加工，亦可以作为废弃资源再利用；因此避免了加工过程中原料及副产物的浪费。

此次试验以金鲳鱼骨为原料进行提取并精炼鱼油，首先通过单因素试验筛选出最佳酶种类及酶解条件，再进一步通过正交试验确定最佳酶解工艺，对提取的金鲳鱼骨油进行理化指标测定及脂肪酸组成分析，为金鲳鱼等水产品加工副产物的高值化利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金鲳鱼，市售。氢氧化钠、盐酸、乙醚、酚酞、碘化钾、磷酸、冰乙酸、异辛烷，均为分析纯，西陇科学股份有限公司；凹凸棒土、酵母粉、淀粉，均为食品级，广东一品鲜生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（50 000 U/g）、中性蛋白酶（20 000 U/g）、胰蛋白酶（10 000 U/g）、碱性蛋白酶（10 000 U/g），南宁庞博生物工程有限公司；胃蛋白酶（30 000 U/g），深圳恒生生物科技有限公司；风味蛋白酶（30 000 U/g），无锡市联合恒洲化工有限公司；所有酶均为食品级；脂肪酸甲酯标准品，美国NuChek-Prep公司。

1.2 仪器与设备

HWS-26超级恒温水浴槽，金坛市盛蓝仪器有限公司；MultifugeX1R高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；LT-DBX23N（热风循环）烘箱，北京普析通用仪器有限公司；FA2204B电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；GM200全新刀片式研磨仪，德国莱驰公司；PB-10酸度计，赛多利斯科学仪器有限公司；7890A气相色谱仪，美国Agilent公司。

1.3 试验方法

1.3.1 金鲳鱼骨鱼油提取的工艺流程

金鲳鱼预处理（去内脏及鱼肉，去掉鱼头）→鱼骨55 ℃烘箱烘干至恒质量→研磨仪（转速10 000 r/min）打碎鱼骨→过孔径0.250 mm筛→鱼骨粉→加入一定量水，调节料液比→加入NaOH/HCl调至各酶的最适pH→加酶升温酶解→灭酶（沸水浴10 min）→离心（5 000 r/min离心10 min）→4 ℃冷藏5 h→倒出酶解液，得粗鱼油→精炼→磷酸脱胶[14]→氢氧化钠脱酸[14]→凹凸棒土脱色[15]→酵母粉脱腥[15]→计算鱼油提取率→鱼油品质评价

1.3.2 金鲳鱼骨鱼油酶解提取的最佳工艺确定

1) 最佳水解酶种类选择。分别采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶和碱性蛋白酶，在各种酶的最适条件（胰蛋白酶：pH 8.0，50 ℃。中性蛋白酶：pH 7.0，50 ℃。胃蛋白酶：pH 2.0，50 ℃[10]。木瓜蛋白酶：pH 7.0，50℃[16]。风味蛋白酶：pH 9.0，55 ℃。碱性蛋白酶：pH10.0，65 ℃[17]）下，添加相同的酶用量2.25×103U/g（以原料计），料液比1∶1（g/mL），酶解时间5 h，筛选出最适合的蛋白酶，以鱼油提取率作为评价指标。鱼油提取率按式（1）计算。

2) 金鲳鱼骨鱼油提取的单因素试验方法。利用木瓜蛋白酶提取金鲳鱼骨鱼油，初步固定酶添加量2.25×103U/g、酶解pH 7.0、料液比1∶1（g/mL）、酶解温度55 ℃、酶解时间5 h，分别展开酶添加量（0.75，1.5，2.25，3和3.75×103U/g）、酶解pH（5，5.5，6，6.5和7）、料液比（1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2和1∶2.5 g/mL）、酶解温度（40，45，50，55和60 ℃）、酶解时间（3，4，5，6和7 h）5个因素的单因素试验，每组试验重复3次，结果取平均值，以鱼油提取率作为评价指标，从而确定最优的单因素条件。

3) 金鲳鱼骨鱼油提取的正交试验设计。根据单因素试验结果，固定木瓜蛋白酶酶解pH 6.0，选择酶添加量（A）、料液比（B）、酶解温度（C）和酶解时间（D）4个因素，各取3个水平，以鱼油提取率为评价指标，进行L9(34)正交试验，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.3.3 金鲳鱼骨鱼油理化指标测定方法

鱼油的感官指标评价参照SC/T 3502—2016；过氧化值的测定参照GB 5009.227—2016；酸值的测定参照GB 5009.229—2016；碘价的测定参照GB/T 5532—2008；水分及挥发物的测定参照GB 5009.236—2016；不溶性杂质的测定参照 GB/T 15688—2008。

1.3.4 气相色谱法分析脂肪酸成分

参照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的测定》，采用GC法分析脂肪酸组成，首先利用碱法对样品甲酯化，取适量样品加入1.5 mL正己烷和40 μL乙酸甲酯，再加入100 μL甲醇钠-甲醇（0.5 mol/L）溶液，在37 ℃下反应20 min，然后置于-20 ℃下冷冻10 min，取出后迅速加入60 μL草酸，离心取上清液，并将上清液通过无水硫酸钠柱以除去其中的水分，氮气吹干，加正己烷复溶，进行气相色谱分析。

气相色谱条件：FID检测器，1 μL自动进样；色谱柱采用熔融石英毛细管柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm，CP-Sil88，Chrompack，Agilent，USA）。进样口温度为250 ℃。炉温为程序升温：45 ℃时保持4 min，然后以13 ℃/min的升温速率将温度升至215 ℃，保持35 min，总测定时间为86 min；检测器的温度为250 ℃，氢气流速为30.0 mL/min；氮气流速为30.0 mL/min。

1.4 数据处理

每个试验重复3次，结果取平均值；单因素试验及正交试验数据采用Excel作图，采用SPSS 17.0进行显著性分析；脂肪酸的组成分析，采用Agilent Chemstation软件对气相色谱数据进行分析处理，通过与脂肪酸甲酯标准对照，采用面积百分比确定各种脂肪酸所占的百分含量（以峰面积的百分比表示）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 蛋白酶种类对金鲳鱼骨鱼油提取率的影响

蛋白酶具有良好的破乳效果，可水解界面蛋白质，降低界面强度，破坏蛋白质和鱼油的结合，促进油滴的聚结和絮凝[18]，释放出油脂。采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶和碱性蛋白酶，在其各自最适温度与pH条件下对金鲳鱼骨进行酶解提油，鱼油提取率结果见图1。在加酶量相同的条件下，木瓜蛋白酶的提油率明显高于其他5种蛋白酶，鱼油提取率可达17.2%；风味蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的提油率在10%左右，胰蛋白酶和胃蛋白酶的提油效果最差，绝大部分鱼油未得到充分的释放。可能是由于不同酶在蛋白质上的作用位点不同，蛋白水解程度也不同；李平等[17]利用5种蛋白酶提取三文鱼鱼皮油脂，也是木瓜蛋白酶酶解效果最好，与此次试验结果一致，推测可能与木瓜蛋白酶的活性位点、酶解环境等有关，木瓜蛋白酶可以切开点羧基侧任一氨基酸残基的肽键[19]，水解效率很高；随着木瓜蛋白酶的水解，与脂质相关的蛋白裂解程度高[20]，从而使鱼油易于释放。

图1 不同种类蛋白酶对金鲳鱼骨鱼油的酶解提油效果比较

2.1.2 木瓜蛋白酶添加量对鱼油提取率的影响

从图2可以看出，随着木瓜蛋白酶添加量的增加，鱼油提取率呈现先增大后减小的趋势。当木瓜蛋白酶添加量为1.5×103U/g时，提取率达到最大值（19.35%）。随着酶量的继续增加，提油率呈现出下降的趋势，原因可能是释放的脂质与肽或磷脂乳化，降低了油脂提取率[21]。Del Valle等[22]指出水解度过高会导致乳状液形成，不利于脂质的释放。因此木瓜蛋白酶的最适添加量为1.5×103U/g。

2.1.3 酶解pH对鱼油提取率的影响

木瓜蛋白酶催化反应的pH范围是3.5～9，最适pH一般为5～7，单因素水平设置以最适范围按等差数列展开。从图3可以看出，随着pH增加，鱼油提取率呈现先增大后稍下降并趋于平缓的趋势；当pH为6.0时，提取率达到最大值（8.56%），因此木瓜蛋白酶的最适pH为6.0。

图2 酶添加量对鱼油提取率的影响

2.1.4 料液比对鱼油提取率的影响

从图4可以知道，料液比在1∶0.5～1∶1.5（g/mL）范围内与酶解提油效果呈正比，水量增加越多，酶解效果越好，鱼油提取率也越好，且在1∶1.5（g/mL）时达到最大值（19.48%）。原因可能是整个酶解系统内水分可以帮助蛋白酶与底物接触充分，提高酶解速度，增加酶解程度，同时脂肪也易于溶出[23]。水量一旦超过限度，水分的增加致使底物浓度降低，造成酶解不完全和油脂提取率降低，因此最佳料液比为1∶1.5（g/mL）。

图3 酶解pH对鱼油提取率的影响

图4 料液比对鱼油提取率的影响

2.1.5 酶解温度对鱼油提取率的影响

木瓜蛋白酶催化反应的温度范围是20～80 ℃，最适温度一般为50～60 ℃，单因素水平设置稍低于最适温度按等差数列展开。由图5可知，鱼油提取率随着温度的上升呈现先增大后减小的趋势，55 ℃时达到最大值（18.28%），随后油脂提取率有逐渐下降，究其原因，蛋白酶生理活性在最适宜温度时达到最高，过高的温度会破坏酶的分子结构从而发生变性，失去活性，降低酶与底物的反应速度[15]。与此同时，温度过高也会加快油脂的氧化导致品质降低。综上所述，较适宜的酶解温度为55 ℃。

图5 酶解温度对鱼油提取率的影响

2.1.6 酶解时间对鱼油提取率的影响

从图6可以看出，金鲳鱼骨鱼油的提取率随初期时间增加而升高，酶解4 h鱼油提取率达到最高（21.44%）；酶解时间4 h后，油脂提取率增速趋于平衡，原因可能是随着时间的增加，木瓜蛋白酶与底物充分接触，作用状态基本达到平衡。此外，随着时间的延长，油脂颜色也逐渐加深，可能是部分多不饱和脂肪酸发生了氧化[24]。综合考虑，最宜酶解时间为4 h。

图6 酶解时间对鱼油提取率的影响

2.2 正交试验结果

由表2的极差R值分析可知，酶添加量（A）、料液比（B）、酶解温度（C）和酶解时间（D）4个因素对提油率的影响主次效应为A＞C＞D＞B，即酶添加量对提油率影响最大，其次是酶解温度，再次是酶解时间，料液比的影响最小。4种因素的最佳组合为A2B3C2D2，即酶添加量1.5×103U/g，料液比1∶1.75（g/mL），酶解温度55 ℃，酶解时间4 h。经验证，鱼油提取率可达24.85%。

王海军等[25]采用稀碱水解法提取鲢鱼骨粗鱼油，提取率为39.83%（折合成占鱼骨的百分比为5.97%）；曹璇等[9]采用超声波辅助稀碱水解法提取金鲳鱼骨油，其提取率为80.51%（折合成占鱼骨的百分比为24.12%）；白艳等[26]用胰蛋白酶提取鳗鱼下脚料的鱼油，提取率为23.87%；薛宇航等[27]采用胰蛋白酶和胃蛋白酶双酶法提取星鳗骨鱼油，提取率为24.44%。此次试验结果远远高于鲢鱼骨油的提取率，与超声波辅助稀碱水解法提取金鲳鱼骨油、酶解法提取鳗鱼下脚料鱼油以及双酶水解星鳗鱼骨油的提取率基本相当；而且此次试验得到的是精炼鱼油，显示出木瓜蛋白酶酶解金鲳鱼骨提油的良好效果和实际应用潜力。

表2 金鲳鱼骨酶解提取鱼油的正交试验结果

2.3 金鲳鱼骨油感官及理化指标的测定结果

依据SC/T 3502—2016，对最佳提取工艺条件下提取精炼的金鲳鱼骨鱼油进行感官评价，结果见表3。金鲳鱼骨鱼油色泽呈淡黄色，澄清透亮，稍有鱼油特有的腥味，无酸败味，感官指标符合SC/T 3502—2016精制油标准。表4为金鲳鱼骨鱼油相关理化指标测定结果。

表3 金鲳鱼骨油感官指标

从表4可以看出，金鲳鱼骨鱼油相关理化指标分别为碘价141.36 g/100 g，过氧化值2.56 meq/kg，不溶性杂质含量0.08%，符合 SC/T 3502—2016精炼鱼油的一级标准；酸值为1.13 mg/g，水分及挥发物含量为0.17%，符合 SC/T 3502—2016精炼鱼油的二级标准。

表4 金鲳鱼骨鱼油理化特性

2.4 金鲳鱼骨鱼油脂肪酸成分分析

采用气相色谱法，分析金鲳鱼骨鱼油肪酸组成，结果见表5。金鲳鱼骨鱼油主要由C12～C22脂肪酸组成，饱和脂肪酸有9种，相对百分含量为36.88%，其中以棕榈酸为主。不饱和脂肪酸相对百分含量为63.05%，其中单不饱和脂肪酸有6种，相对百分含量为32.80%，主要由油酸组成；多不饱和脂肪酸有10种，相对百分含量为30.27%，其中亚油酸的含量最高，其次为α-亚麻酸、DHA，同时还含有少量的EPA、DPA。郭萌萌等[28]通过GC法分析金鲳鱼鱼骨主要脂肪酸组成，其饱和脂肪酸含量为32.82%，单不饱和脂肪酸含量为34.27%，多不饱和脂肪酸含量为31.84%；油酸含量为26.91%、亚油酸含量为21.88%；曹璇等[9]采用GC/MS对超声波辅助稀碱水解法提取的金鲳鱼骨油脂肪酸C7～C24成分分析发现，金鲳鱼骨油中饱和脂肪酸含量为31.56%，不饱和脂肪酸含量为68.44%；其中单不饱和脂肪酸总量为37.99%，多不饱和脂肪酸总量为30.45%；其中油酸（27.86%）和棕榈酸（21.46%）含量最高，富含亚油酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸。此次试验与已报道的金鲳鱼骨油脂肪酸测定结果基本一致。

表5 金鲳鱼骨鱼油脂肪酸组成及含量

3 结论

此次试验以金鲳鱼骨为原料，通过单因素试验及正交试验，最终得到金鲳鱼骨鱼油酶解提取的最佳工艺参数：木瓜蛋白酶为最佳水解酶，在pH 6.0条件下，添加量1.5×103U/g，料液比1∶1.75（g/mL），酶解温度55 ℃，酶解时间4 h，最佳工艺条件下的提取率为24.85%；采用木瓜蛋白酶酶解鱼骨提取鱼油提取条件温和，鱼油质量好、纯度高。所得鱼油色泽呈淡黄色，澄清透亮，具有鱼油特有的微腥味，无酸败味，感官指标符合SC/T 3502—2016精制鱼油的标准；碘价、过氧化值、不溶性杂质3项指标符合SC/T3502—2016的一级标准；酸值、水分及挥发物指标符合SC/T 3502—2016的二级标准；气相色谱分析表明，酶解法提取的金鲳鱼骨鱼油以棕榈酸、油酸、亚油酸含量最高，不饱和脂肪酸含量（63.05%）远高于饱和脂肪酸含量（36.88%），其中单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸含量分别为32.80%和30.27%，亚麻酸和DHA含量较高，表明金鲳鱼骨油是一种较高品质的油脂。此次试验可以为综合利用金鲳鱼加工副产物提供参考。