HPLC技术对贺兰山东麓酿酒葡萄中酚酸类物质的检测方法研究

杨静，赵子丹，牛艳，吴燕，王晓菁，张艳

(宁夏农产品质量标准与检测技术研究所，宁夏 银川 750002)

酚类物质作为葡萄中最丰富的次生代谢产物，具有抗炎、抗菌、抗氧化等功效[1-3]，主要分为类黄酮和非类黄酮两大类。酚酸作为一种非类黄酮物质，以游离态和结合态2种形式存在于植物体中[4-8]。许多研究表明，酚酸具有清除自由基的作用，有很强的抗氧化能力。中国的鲜食葡萄产业发展迅速，种植面积不断增加。现阶段，我国已基本形成宁夏贺兰山东麓、新疆天山北麓等十大葡萄产区，其中以宁夏贺兰山东麓为代表的西部产区近年来颇受关注[9-11]。它是继河北昌黎、山东烟台之后，第三个被国家认定为葡萄酒原产地保护认证的产区，是国际公认的酿酒葡萄最佳产区之一，属于世界优质酿酒葡萄的种植“黄金地带”[12-15]。宋文风等[4]对葡萄果实的酚酸提取进行了优化，使酚酸的提取方法简单方便；张星星等[16-19]用UPLC技术快速测定葡萄酒中的酚类物质，使酚酸的检测时间缩短。

本研究以贺兰山东麓酿酒葡萄为主要研究对象，采用高效液相色谱技术，通过建立贺兰山东麓酿酒葡萄中酚酸的组成和含量的检测方法，分析酚酸在不同品种、产区中葡萄的组成分布和差异，为提高酿酒葡萄的品质提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)购自美国Fisher公司；乙酸乙酯、乙醚(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；超纯水(过0.45 μm滤膜)；没食子酸、原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸，为标准对照品(≥98%，国药集团化学试剂有限公司)。购买酿酒葡萄作为实验材料。

1.2 仪器与设备

Waters e2695液相色谱仪-配2487紫外检测器(美国Waters公司)；电子天平(精度为0.000 1 g)；涡旋混匀器(德国MS3 digital)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；离心机(上海安亭TDL-40)；纯水机(美国Millipore公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒DHG-9240A型)。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

本实验以酚酸为标准对照品。准确称取10.000 0 mg标准对照品(精确到0.000 1 g)，用10 mL甲醇配置成1 000 mg·L-1的标准母液，保存于-20 ℃。临用前，用甲醇溶液稀释成一系列质量浓度的标准品溶液(0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、30.0 mg·L-1)。

1.3.2 样品前处理

采集的酿酒葡萄经纯水清洗擦干后，用高速匀浆机匀浆后，放于-20 ℃避光保存。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Agilent-ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脱，洗脱程序见表1；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量为10 μL；波长为280 nm。

表1 流动相配比及洗脱时间

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱条件的确定

2.1.1 流动相的确定

经高效液相色谱检测发现，以甲醇/水、乙腈/水为流动相，均不能有效分离目标成分酚酸。以乙腈/0.1%甲酸水溶液为流动相，Agilent-ZORBAX SB-C18色谱柱可以有效分离目标成分酚酸(图1)。

1—没食子酸；2—原儿茶酸；3—4-羟基苯甲酸；4—香草酸；5—丁香酸。图1 波长280 nm酚酸标准品的色谱

2.1.2 样品前处理方法的优化

不同提取试剂对酚酸的提取。本研究选取乙腈、甲醇、乙酯乙酯+乙醚对酿酒葡萄中酚酸进行提取。用乙腈和甲醇作为提取试剂无法将酚酸完全分离且提取杂质较多，而用乙酸乙酯+乙醚提取，杂质较少，组分能完全分离且提取也比较完全(图2)。

a—乙腈提取；b—甲醇提取；c—乙酸乙酯+乙醚提取；1—没食子酸；2—原儿茶酸；3—4-羟基苯甲酸；4—香草酸；5—丁香酸。图2 不同提取试剂的酚酸色谱

不同提取方式对酚酸提取的影响。准确称取5.00 g葡萄样品，加入20 mL乙酸乙酯+乙醚(V/V，1/1)，分别采用匀浆2 min、超声10 min、振荡10 min对酚酸进行提取。提取后全部浓缩，2 mL甲醇定容，过0.22 μm滤膜，上机待测。结果表明，当采用振荡提取时提取效果最好(图3)。

图3 提取方式对酿酒葡萄中酚酸含量的影响

不同称样质量对酚酸提取的影响。分别称取1.00、2.00、4.00、5.00、6.00、8.00、10.00 g葡萄样品，对酚酸进行10.00 mg·kg-1的添加回收，加入20 mL乙酸乙酯+乙醚(V/V，1/1)振荡10 min对酚酸进行提取，测定其回收率。当称样质量为5.00 g时，回收率最高，说明能将酿酒葡萄中的酚酸提取完全(图4)。

图4 称样质量对酿酒葡萄中酚酸含量的影响

2.1.3 酿酒葡萄样品的高效液相色谱

通过确定的液相色谱条件和前处理条件对酿酒葡萄样品中的酚酸进行检测，得到样品空白的色谱图，结果表明，前述确定的色谱条件和前处理条件对空白样品无干扰(图5)。

1—没食子酸；2—原儿茶酸；3—4-羟基苯甲酸；4—香草酸；5—丁香酸。图5 酿酒葡萄中酚酸液相色谱

2.1.4 酚酸的标准曲线、线性范围及检出限将酚酸的标准溶液母液稀释成0.2、0.5、1.0、5.0、10、30 mg·L-1的标准溶液系列，采用外标峰面积定量，以各酚酸的标准品的峰面积为纵坐标(y)，以其浓度为横坐标(x)，各酚酸的回归方程、相关数和方法检出限如表2。在0.2～30.0 mg·L-1，各种酚酸在相应浓度范围内线性关系良好，相关系数在0.999 3～1.000 0，检出限为0.02～0.04 mg·kg-1。据此确定在实验范围内仪器响应信号与进样量呈良好的线性关系。

表2 5种酚酸的标准曲线回归方程、相关系数、检出限

2.1.5 精密度

将同一酚酸标准混合溶液，按照确定的色谱条件连续进样6次，测定各标准物质的峰面积，计算峰面积的相对标准偏差(RSD)来考察色谱方法的精密度。实验结果表明：没食子酸的RSD为0.25%，原儿茶酸的RSD为1.36%，4-羟基苯甲酸的RSD为3.58%，香草酸的RSD为4.67%，丁香酸的RSD为0.98%，充分说明该方法具有较高的精密度。

2.1.6 加标回收率

以酿酒葡萄品种赤霞珠为实验材料，添加浓度分别为1.0、10.0、30.0 mg·L-1，每个浓度重复5次。采用已确定的前处理方法进行提取，经高效液相色谱检测，计算样品中酚酸的回收率。没食子酸的平均回收率为73.3%～95.1%，RSD为2.4%～5.6%；原儿茶酸的平均回收率为75.3%～79.4%，RSD为1.8%～5.9%；4-羟基苯甲酸的平均回收率为73.9%～105.1%，RSD为4.0%～5.8%；香草酸的平均回收率为78.7%～91.1%，RSD为5.0%～7.8%；丁香酸的平均回收率为74.3%～78.4%，RSD为3.3%～5.0%(表3)。样品的回收率、重复性均能满足检测要求，表明方法的准确度高、精密度好，完全能满足酿酒葡萄中酚酸的检测要求。

表3 5种酚酸组分的回收率实验结果(n=5)

按照上述条件进行检测，酿酒葡萄样品空白及样品中添加标准品的液相色谱图，见图6、图7。

1—没食子酸；2—原儿茶酸；3—4-羟基苯甲酸；4—香草酸；5—丁香酸。图6 酿酒葡萄样品空白色谱图

1—没食子酸；2—原儿茶酸；3—4-羟基苯甲酸；4—香草酸；5—丁香酸。图7 酿酒葡萄样品添加回收色谱图(10.0 mg·L-1)

2.2 酿酒葡萄中酚酸含量

2.2.1 不同品种酿酒葡萄中酚酸含量

酿酒葡萄中主要酚酸为没食子酸和丁香酸，而4-羟基苯甲酸、原儿茶酸和香草酸含量较低(图8)。赤霞珠的酚酸含量最高，之后依次为梅鹿辄、黑比诺、蛇龙珠、桑娇维赛、霞多丽、威代尔。没食子酸、原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸和丁香酸最高的葡萄品种分别为赤霞珠(19.3 mg·kg-1)、霞多丽(3.7 mg·kg-1)、黑比诺(2.3 mg·kg-1)、黑比诺(3.8 mg·kg-1)、赤霞珠(26.5 mg·kg-1)。说明没食子酸和丁香酸在一定程度上可以体现出酿酒葡萄中酚酸总含量情况。

图8 不同品种酿酒葡萄中酚酸含量

2.2.2 不同产地酿酒葡萄中酚酸含量

图9为红寺堡汇达酒庄、永宁玉泉营、青铜峡御马酒庄3个产区酿酒葡萄酚酸含量。蛇龙珠酿酒葡萄没食子酸、原儿茶酸、香草酸和丁香酸在永宁玉泉营产区表现最好，分别为10.1、3.7、10.2、8.4 mg·kg-1，4-羟基苯甲酸在红寺堡汇达酒庄产区表现最好，为0.35 mg·kg-1(图9)；梅鹿辄酿酒葡萄没食子酸、原儿茶酸、香草酸在永宁玉泉营产区表现最好，分别为11.5、9.0、4.5 mg·kg-1，4-羟基苯甲酸和丁香酸在青铜峡御马酒庄产区表现最好，分别为0.64、22.8 mg·kg-1；赤霞珠酿酒葡萄没食子酸、原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸和丁香酸在红寺堡汇达酒庄产区表现最好，分别为19.3、2.9、0.95、2.5、26.5 mg·kg-1。

图9 不同产地酿酒葡萄中酚酸含量

2.3 葡萄中酚酸的主成分分析

主成分分析的目的主要在于利用原变量间具有较强相关性的特点，对多变量进行降维，缩减成较少维度的数据，并且对降维后的特征指标进行线性变换，用少量指标反映原始大量数据所提供的大部分信息[20-21]。利用SPSS 25.0数据处理软件对酿酒葡萄中的5种酚酸含量进行主成分分析，得到主成分的特征值、贡献率和累积贡献率(表4)。特征值>1的共计2个主成分，第1主成分的贡献率为48.346%，第2主成分的贡献率为26.888%，这2个成分的累积贡献率为75.234%，说明2个主成分能很好的反映原始数据绝大部分信息，因此,构成酿酒葡萄酚酸组分特征的物质由最初5个降到了2个主成分，成功达到了降维目的。

表4 各主成分的特征值和累积贡献率

第1主成分主要是由丁香酸和没食子酸构成，第2主成分为4-羟基苯甲酸。得分系数反映各个指标对主成分影响程度的判定依据，通过得分系数将各个变量进行线性组合，建立关于第1主成分(Y1)和第2主成分(Y2)与丁香酸(X1)、没食子酸(X2)、香草酸(X3)、原儿茶酸(X4)、4-羟基苯甲酸(X5)这5个变量得分系数模型(表5)。因此第1主成分可以提取为Y1=0.376X1+0.365X2+0.358X3+0.345X4-0.070X5；第2主成分可以提取为Y2=0.246X1+0.033X2-0.099X3-0.366X4+0.849X5。

表5 主成分载荷矩阵

3 小结与结论

本研究采用超高效液相色谱仪测定贺兰山东麓7个品种酿酒葡萄中5种酚酸含量。样品的回收率、精密度均能满足检测要求，表明方法的准确度高、精密度好，完全能满足酿酒葡萄中酚酸的检测要求。将本方法应用于不同品种中贺兰山东麓酿酒葡萄的测定，结果表明不同品种酿酒葡萄的酚酸均有检出。由于含量高的成分不一定代表酿酒葡萄酚酸主成分，因此,用主成分分析法进行分析，经分析提取出2种主成分，其累积贡献率达到75.234%。第1主成分为丁香酸和没食子酸，第2主成分为4-羟基苯甲酸。实验采用统计学方法探讨了酿酒葡萄中酚酸含量，为酿酒葡萄在今后葡萄酒酿制工艺提供了重要参考价值。