鲍若晗,王云冰
(台州科技职业学院,浙江 台州 318020)
青钱柳属胡桃科青钱柳属,是冰川世纪幸存下来的国家2级保护树种,仅存于我国,是集经济、观赏、保健、治疗于一体的珍惜保护树种[1],是一种我国特有的保健物种资源。研究表明,青钱柳叶含有黄酮、三萜、多糖、内酯类等活性物质[2],具有降血糖、降血压、降血脂、抗氧化、抑菌等生物活性功能[3]。多糖是目前研究较多的活性物质,其提取方法主要有热水浸提法,酸、碱提取法,但提取效率不高[4],并且会破坏多糖活性。国内外的研究成果表明,超声辅助提取技术具有很大的研究前景[5]。本项目采用超声辅助提取青钱柳多糖,探索提取时间、提取温度、液料比对提取效果的影响,并研究活性炭的脱色效果,为后续的产品开发奠定基础。
DFY-200摇摆式高速粉碎机(上海新诺仪器设备有限公司)、电热真空干燥箱DZG-6050(上海森信有限公司)、电子恒温水浴锅XT5205(常州国化有限公司)、JN-120D型超声波清洗机(宁波江南仪器厂)、SHB-111型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、精密电子天平ATY224(岛津仪器有限公司)、真空冷冻干燥机(宁波新芝仪器有限公司)、紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。
青钱柳叶片,由百花园林有限公司提供。所用试剂没食子酸、碳酸钠、葡萄糖、苯酚均为分析纯。
青钱柳叶于50~60 ℃烘干,进行超微粉碎,过200目筛(0.149 mm)后,粉末收集备用。
吸取0.2 mL的青钱柳提取液,用蒸馏水补至2.0 mL,然后加入6%苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL,摇匀冷却室温放置20 min,用紫外可见分光光度计在波长为490 nm处测定[6]。以标准曲线计算多糖含量。
分别考察提取时间、提取温度、液料比对多糖得率的影响。
1.5.1 提取时间的影响
称取1 g干燥青钱柳叶于烧杯中,加入30 mL蒸馏水,用洁净的玻璃棒搅拌均匀,将样品放入超声波振荡器震荡处理,处理时间分别为20、30、40、50 min,控制提取温度为50 ℃,用布氏漏斗真空抽滤得滤液,再用真空冷冻干燥设备将提取液浓缩至黏稠状。最后测定多糖含量。
1.5.2 提取温度的影响
称取1 g干燥青钱柳叶于烧杯中,加入30 mL蒸馏水,用洁净的玻璃棒搅拌均匀,将样品放入超声波振荡器震荡30 min,控制提取温度分别为45、55、65、75 ℃,用布氏漏斗真空抽滤得滤液,再用真空冷冻干燥设备将提取液浓缩至黏稠状。最后测定多糖含量。
1.5.3 液料比的影响
称取1 g干燥青钱柳叶,分别加入20、30、40、50 mL蒸馏水,用洁净的玻璃棒搅拌,超声波提取40 min,控制温度为50 ℃,用布氏漏斗真空抽滤后得滤液,再用真空冷冻干燥设备将提取液浓缩至黏稠状。最后测定多糖含量。
在单因素实验的基础上,以多糖含量为响应值,进行BBD实验。采用Design expert 8.0进行数据分析。-1水平提取时间为45 min,提取温度20 ℃,液料比20∶1 mL·g-1;1水平提取时间为75 min,提取温度50 ℃,液料比50∶1 mL·g-1。
1.7.1 活性炭添加量的影响
将提取液在未经过真空冷冻干燥设备前,用纯净水定容到50 mL,然后在提取液中分别加入0%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的活性炭,静置40 min后,用布氏漏斗真空抽滤后得滤液。观察脱色效果,同时测定脱色后提取液中的多糖含量,并与脱色前进行比较。
1.7.2 活性碳脱色时间的影响
将提取液在未经过真空冷冻干燥设备前,用纯净水定容到50 mL,然后在提取液中加入1.0%活性炭,分别静置30、40、50、60、70 min后,用布氏漏斗真空抽滤后得滤液。观察脱色效果,同时测定脱色后提取液中的多糖含量,并与脱色前进行比较。
提取时间、提取温度和液料比对多糖含量的影响分别见图1~3。由图1可知,提取时间在20~30 min时,随着时间延长,多糖含量下降;30~40 min时,随着时间延长,多糖溶出增多,多糖含量升高;但40 min以后升高趋势变缓。可能是由于提取一定时间以后,多糖已经基本溶出,再延长提取时间,一方面超声作用会破坏部分大分子的多糖,另一方面,杂质溶出增多,影响多糖溶出,因此,选择40 min作为BBD实验中心点。
图1 提取时间对多糖含量的影响
由图2可知,随着提取温度的升高,多糖含量升高,但65 ℃以上升高趋势变缓,可能是由于温度过高,多糖不稳定,被分解或氧化,影响提取率,因此,选择65 ℃作为BBD实验中心点。
图2 提取温度对多糖含量的影响
由图3可知,在液料比5∶1~10∶1 mL·g-1过程中,随着液料比升高,多糖含量也升高,因为随着液料比升高,液固接触几率增大,同时较高的液料比也加快了水的传质作用,提高了多糖的提取率。在液料比10∶1~20∶1 mL·g-1过程中,多糖含量升高趋势变缓,可能是由于此时,大部分多糖已溶出,提高液料比对提升多糖提取率影响不大。在液料比20∶1~30∶1 mL·g-1过程中,随着液料比升高,多糖含量下降,可能是由于多糖已基本溶出后,再增加液料比会使杂质溶出增多,抑制多糖溶出,因此,选择20∶1 mL·g-1作为BBD实验中心点。
图3 液料比对多糖含量的影响
在单因素实验的基础上,进行BBD实验(表1)。通过Design expert 8.0软件分析得到最佳提取条件,即液料比20∶1 mL·g-1、提取时间50 min、提取温度60 ℃,模型的预测值与实际值拟合见图4,预测值和实际值在一条直线上,说明预测可靠。
表1 BBD(Box-Behnken)实验结果
图4 模型预测与实测比较
加入活性炭脱色后,提取液颜色随着活性炭添加量的增加而稍有变浅,但是变化并不明显,活性炭浓度大于1.2%以后基本没有变化。活性炭添加量对多糖含量的影响见图5,添加活性炭后,多糖含量明显下降,可能是活性炭对多糖有吸附作用。
图5 活性炭添加量对多糖含量的影响
脱色时间在0~20 min时,随着脱色时间的延长,提取液液色稍有变浅,在20~70 min时,颜色几乎不变。脱色时间对多糖含量的影响见图6,在0~20 min时,多糖含量下降迅速,随着时间的延长下降趋缓,可能是活性炭对多糖的吸附趋于饱和。综上所述,活性炭对青钱柳提取液的脱色效果不明显,而且吸附较大,不适合用于提取液的脱色。
图6 脱色时间对多糖含量的影响
以青钱柳叶为研究对象,采用超声辅助提取法,在单因素实验的基础上采用BBD实验,考察提取时间、提取温度、液料比对多糖含量的影响。结果表明,当液料比为20∶1 mL·g-1,提取时间为50 min,提取温度为60 ℃时青钱柳多糖提取率最高,达16.5%;较之传统热水提取法的4.3%,本实验方法有所提高。
采用活性炭对提取液进行脱色,考察活性炭添加量和脱色时间对多糖含量的影响,结果发现,活性炭对青钱柳提取液的脱色效果不明显,而且吸附较大,不适合用于提取液的脱色。