超声辅助法提取青钱柳多糖

鲍若晗，王云冰

(台州科技职业学院，浙江 台州 318020)

青钱柳属胡桃科青钱柳属，是冰川世纪幸存下来的国家2级保护树种，仅存于我国，是集经济、观赏、保健、治疗于一体的珍惜保护树种[1]，是一种我国特有的保健物种资源。研究表明，青钱柳叶含有黄酮、三萜、多糖、内酯类等活性物质[2]，具有降血糖、降血压、降血脂、抗氧化、抑菌等生物活性功能[3]。多糖是目前研究较多的活性物质，其提取方法主要有热水浸提法，酸、碱提取法，但提取效率不高[4]，并且会破坏多糖活性。国内外的研究成果表明，超声辅助提取技术具有很大的研究前景[5]。本项目采用超声辅助提取青钱柳多糖，探索提取时间、提取温度、液料比对提取效果的影响，并研究活性炭的脱色效果，为后续的产品开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

DFY-200摇摆式高速粉碎机(上海新诺仪器设备有限公司)、电热真空干燥箱DZG-6050(上海森信有限公司)、电子恒温水浴锅XT5205(常州国化有限公司)、JN-120D型超声波清洗机(宁波江南仪器厂)、SHB-111型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、精密电子天平ATY224(岛津仪器有限公司)、真空冷冻干燥机(宁波新芝仪器有限公司)、紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

1.2 试剂与材料

青钱柳叶片，由百花园林有限公司提供。所用试剂没食子酸、碳酸钠、葡萄糖、苯酚均为分析纯。

1.3 青钱柳超微粉末的制备

青钱柳叶于50～60 ℃烘干，进行超微粉碎，过200目筛(0.149 mm)后，粉末收集备用。

1.4 多糖的测定

吸取0.2 mL的青钱柳提取液，用蒸馏水补至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，摇匀冷却室温放置20 min，用紫外可见分光光度计在波长为490 nm处测定[6]。以标准曲线计算多糖含量。

1.5 单因素实验

分别考察提取时间、提取温度、液料比对多糖得率的影响。

1.5.1 提取时间的影响

称取1 g干燥青钱柳叶于烧杯中，加入30 mL蒸馏水，用洁净的玻璃棒搅拌均匀，将样品放入超声波振荡器震荡处理，处理时间分别为20、30、40、50 min，控制提取温度为50 ℃，用布氏漏斗真空抽滤得滤液，再用真空冷冻干燥设备将提取液浓缩至黏稠状。最后测定多糖含量。

1.5.2 提取温度的影响

称取1 g干燥青钱柳叶于烧杯中，加入30 mL蒸馏水，用洁净的玻璃棒搅拌均匀，将样品放入超声波振荡器震荡30 min，控制提取温度分别为45、55、65、75 ℃，用布氏漏斗真空抽滤得滤液，再用真空冷冻干燥设备将提取液浓缩至黏稠状。最后测定多糖含量。

1.5.3 液料比的影响

称取1 g干燥青钱柳叶，分别加入20、30、40、50 mL蒸馏水，用洁净的玻璃棒搅拌，超声波提取40 min，控制温度为50 ℃，用布氏漏斗真空抽滤后得滤液，再用真空冷冻干燥设备将提取液浓缩至黏稠状。最后测定多糖含量。

1.6 BBD(Box-Behnken)实验

在单因素实验的基础上，以多糖含量为响应值，进行BBD实验。采用Design expert 8.0进行数据分析。-1水平提取时间为45 min，提取温度20 ℃，液料比20∶1 mL·g-1；1水平提取时间为75 min，提取温度50 ℃，液料比50∶1 mL·g-1。

1.7 活性炭脱色实验

1.7.1 活性炭添加量的影响

将提取液在未经过真空冷冻干燥设备前，用纯净水定容到50 mL，然后在提取液中分别加入0%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的活性炭，静置40 min后，用布氏漏斗真空抽滤后得滤液。观察脱色效果，同时测定脱色后提取液中的多糖含量，并与脱色前进行比较。

1.7.2 活性碳脱色时间的影响

将提取液在未经过真空冷冻干燥设备前，用纯净水定容到50 mL，然后在提取液中加入1.0%活性炭，分别静置30、40、50、60、70 min后，用布氏漏斗真空抽滤后得滤液。观察脱色效果，同时测定脱色后提取液中的多糖含量，并与脱色前进行比较。

2 结果与分析

2.1 单因素

提取时间、提取温度和液料比对多糖含量的影响分别见图1～3。由图1可知，提取时间在20～30 min时，随着时间延长，多糖含量下降；30～40 min时，随着时间延长，多糖溶出增多，多糖含量升高；但40 min以后升高趋势变缓。可能是由于提取一定时间以后，多糖已经基本溶出，再延长提取时间，一方面超声作用会破坏部分大分子的多糖，另一方面，杂质溶出增多，影响多糖溶出，因此，选择40 min作为BBD实验中心点。

图1 提取时间对多糖含量的影响

由图2可知，随着提取温度的升高，多糖含量升高，但65 ℃以上升高趋势变缓，可能是由于温度过高，多糖不稳定，被分解或氧化，影响提取率，因此，选择65 ℃作为BBD实验中心点。

图2 提取温度对多糖含量的影响

由图3可知，在液料比5∶1～10∶1 mL·g-1过程中，随着液料比升高，多糖含量也升高，因为随着液料比升高，液固接触几率增大，同时较高的液料比也加快了水的传质作用，提高了多糖的提取率。在液料比10∶1～20∶1 mL·g-1过程中，多糖含量升高趋势变缓，可能是由于此时，大部分多糖已溶出，提高液料比对提升多糖提取率影响不大。在液料比20∶1～30∶1 mL·g-1过程中，随着液料比升高，多糖含量下降，可能是由于多糖已基本溶出后，再增加液料比会使杂质溶出增多，抑制多糖溶出，因此，选择20∶1 mL·g-1作为BBD实验中心点。

图3 液料比对多糖含量的影响

2.2 BBD(Box-Behnken)实验

在单因素实验的基础上，进行BBD实验(表1)。通过Design expert 8.0软件分析得到最佳提取条件，即液料比20∶1 mL·g-1、提取时间50 min、提取温度60 ℃，模型的预测值与实际值拟合见图4，预测值和实际值在一条直线上，说明预测可靠。

表1 BBD(Box-Behnken)实验结果

图4 模型预测与实测比较

2.3 活性炭脱色

加入活性炭脱色后，提取液颜色随着活性炭添加量的增加而稍有变浅，但是变化并不明显，活性炭浓度大于1.2%以后基本没有变化。活性炭添加量对多糖含量的影响见图5，添加活性炭后，多糖含量明显下降，可能是活性炭对多糖有吸附作用。

图5 活性炭添加量对多糖含量的影响

脱色时间在0～20 min时，随着脱色时间的延长，提取液液色稍有变浅，在20～70 min时，颜色几乎不变。脱色时间对多糖含量的影响见图6，在0～20 min时，多糖含量下降迅速，随着时间的延长下降趋缓，可能是活性炭对多糖的吸附趋于饱和。综上所述，活性炭对青钱柳提取液的脱色效果不明显，而且吸附较大，不适合用于提取液的脱色。

图6 脱色时间对多糖含量的影响

3 小结

以青钱柳叶为研究对象，采用超声辅助提取法，在单因素实验的基础上采用BBD实验，考察提取时间、提取温度、液料比对多糖含量的影响。结果表明，当液料比为20∶1 mL·g-1，提取时间为50 min，提取温度为60 ℃时青钱柳多糖提取率最高，达16.5%；较之传统热水提取法的4.3%，本实验方法有所提高。

采用活性炭对提取液进行脱色，考察活性炭添加量和脱色时间对多糖含量的影响，结果发现，活性炭对青钱柳提取液的脱色效果不明显，而且吸附较大，不适合用于提取液的脱色。