紫萼组织培养技术

高燕，奉树成

(上海植物园 上海城市植物资源开发应用工程技术研究中心，上海 200231)

紫萼(Hostaventricosa)是百合科玉簪属植物，为我国原产玉簪属4个品种之一[1]。紫萼叶丛生有光泽，卵形至卵圆形。花葶高60～100 cm，花紫色，花期6—7月，观赏期长，耐寒、耐旱，对土壤要求不高，适应性强，管理粗放，是一种优异的耐阴宿根草本。园林中常用于林下地被，或与周边建筑山石搭配成景，也可用于盆栽、切花、切叶等[2-5]。除了园林观赏应用价值外，紫萼还具有药用价值，紫萼的嫩叶和嫩芽可食用。因此，紫萼极具开发价值。由于紫萼玉簪野生种较少，童龄期长，从播种到开花需3年以上时间[3]。紫萼是玉簪属中唯一的天然4倍体，存在不完全无配生殖现象，母本不能产生杂种后代，种子不育[6]。研究紫萼的组织培养快繁技术，可以保证紫萼性状的稳定性，也为紫萼的推广提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2018—2020年在上海植物园实施，材料取自上海植物园玉簪资源圃。试验以紫萼幼嫩花序部分为材料。取材后，将材料截取为2～4 cm的小段待用。

1.2 方法

取紫萼幼嫩花序部位，用洗洁精浸泡30 min，流水冲洗30 min。前期准备75%酒精和2%次氯酸钠溶液，灭菌ddH2O、三角瓶、镊子、手术刀和滤纸待用。

1.2.1 灭菌

试验工作均在灭菌后的超净工作台上实施。外植体放置于无菌三角瓶中，先用无菌水震荡清洗1次，再用75%酒精震荡清洗30 s，无菌水冲洗2次。随后用2%次氯酸钠溶液消毒外植体，消毒时间设置情况如表1所示。外植体消毒后用无菌水冲洗5次，再用滤纸吸干水分后接种于培养基上。根据污染情况和芽的诱导情况选择最佳灭菌方法。

1.2.2 诱导

以MS为基本培养基，设置激素梯度。激素采用6-BA和NAA两种激素组合促进不定芽诱导，激素组合方式如表2所示。根据诱导状态和诱导率决定最佳诱导方法。

1.2.3 增殖

以MS为基本培养基，添加不同浓度的细胞分裂素6-BA、生长素2,4-D和NAA，组合情况如表3所示，形成增殖培养基。经过25 d的生长，比较生长状态和增殖率，确定最佳增殖培养基。

1.2.4 生根

以1/2 MS为基本培养基添加不同激素，激素采用IBA和ABT两种，浓度情况如表4所示。经过30 d生根培养，对比根的发育状态、生根率、根长等情况，确定最佳生根培养基。

1.2.5 炼苗

室温下打开瓶盖放置3 d后，用流水清洗组培苗附着的培养基，整理根并种植于营养钵中，观察苗的生长状态。

2 结果与分析

2.1 灭菌

本试验采用2%次氯酸钠溶液进行灭菌，灭菌时间如表1所示，分别为7、14和21 min，对应的污染率和出芽率呈现不同的变化。从污染率看出A1污染率较高，A2和A3之间没有显著差异，相比较A2可以达到比较好的灭菌效果。从出芽率看，A2出芽率最高为44.4%，与其他2组有显著差异。综合考虑，以2%次氯酸钠溶液灭菌14 min为最优的紫萼灭菌时间。

表1 不同灭菌时间对紫萼污染率和出芽率的影响

2.2 诱导

以MS为基本培养基添加不同浓度细胞分裂素6-BA和生长素NAA，细胞分裂素6-BA浓度在2～6 mg·L-1，生长素NAA浓度在0～0.5 mg·L-1，如表2所示。6-BA为2 mg·L-1时，诱导率较低，且芽生长停滞或缓慢；6-BA为4 mg·L-1时，诱导率相比较有增长，其中NAA为0.2 mg·L-1时，诱导率达到最高为46.3%，诱导出芽生长迅速，芽生长正常，展叶健康；6-BA浓度再增加后，起始材料与培养基接触部位开始出现绿色愈伤，极个别芽小而畸形，诱导率也随之下降。因此，最优诱导配方为B5。

表2 不同激素含量对紫萼诱导的影响

2.3 增殖

诱导30 d后，将诱导出的健康芽转至增殖培养基。增殖培养基采用MS培养基添加6-BA 0.5～4 mg·L-1，生长素NAA 0～0.5 mg·L-1，2,4-D 0～0.5 mg·L-1。采用L9(34)正交试验，试验结果如表3所示。

表3 不同激素含量对紫萼芽增殖的影响

从伸长倍率来看，C4和C9的伸长倍率值最高，均为3.5，没有显著差异。从增殖倍率考虑，C6增殖倍率最高为6.0，其次为C9，增殖倍率为3.9。结合生长状况观察，C4植株生长正常，叶片宽大，无畸形，但增殖速度很慢。C6增殖速度快，但植株几乎不伸长，叶片细弱，展叶不明显，部分基部开始出现玻璃化情况。C9叶片增殖速度较快，伸长倍速较高，生长正常，叶片宽大，无畸形(图1)。因此，C9为增殖最优培养基。

图1 C9培养基上增殖22 d情况

2.4 生根

将健康植株从增殖培养基转移至生根培养基。生根培养以1/2 MS为基本培养基添加ABT或IBA，观察生根情况(图2)。

图2 D6培养基上生根20 d情况

生根情况如表4所示，添加IBA或ABT均可诱导生根，但生根率有较大差异。与ABT相比较，ABT生根率明显低，且根粗短，叶片略黄，相比而言ABT更适合紫萼生根。ABT浓度为0.5 mg·L-1时紫萼状态为佳，经过30 d的培养，叶片浓绿，生根数量4～6根，长度2～9 cm，根粗壮，整体植株形态正常。

表4 不同激素含量对紫萼生根的影响

2.5 炼苗

组培苗经过1个月的生根培养形成健壮根后，可进行炼苗(图3)。穴盘中装入适量基质，基质采用园土∶泥炭∶珍珠岩为1∶3∶1(体积比)。

图3 紫萼炼苗20 d生长情况

打开瓶盖，将紫萼放在培养间3 d，取出后用流水冲洗干净培养基，种植于基质中，用多菌灵浇透，放置于大棚，温度20～30 ℃，湿度85%左右。每15 d左右用多菌灵浇透一次。生长2个月，成活率可达到97%以上。

2.6 育苗技术培养

紫萼作为典型的阴生植物，要求土壤排水良好，土层深厚。种植地点宜选择凉爽通风的阴湿环境，例如树下、建筑物背阴处[4]。紫萼经过2个月的炼苗，形成根系优良、展叶完全的完整植株后，可移入林下或背阴处排水良好的土壤中露地种植。挖穴深度4～10 cm，保证根不外露、深不埋心，覆土与地面平齐即可，栽植后浇透水使土壤与根系充分接触。地栽时可按薄肥勤施的原则添加有机肥或者少量磷肥，促进生长。

3 小结与讨论

1976年已经有关于玉簪属种和品种的离体培养研究。至今对不同的玉簪属种和品种分别从外植体、再生方式等方面进行组织培养的研究，外植体包括茎尖、花序、花器、花序切片、花瓣、子房、花葶组织等，再生方式包括不定苗、多芽苗等[7-9]。李玲等[1]以野生紫萼玉簪叶片为外植体，通过愈伤组织诱导不定芽形成完整植株。蒋素华等[4]以紫萼幼苗为外植体，通过愈伤组织诱导不定芽建立再生体系。陈必胜等[10]以玉簪基部幼芽为外植体进行组织培养研究，发现冬芽优于春芽。Lubomski[11]的研究成果表明，再生能力最强的是茎尖、花蕾和叶柄较低部位。本试验取紫萼幼嫩花序为起始材料。

植物组织培养中使用较多的灭菌消毒剂包括乙醇、升汞、次氯酸钠等溶液，有时候适量添加吐温增加渗透性提高灭菌效率[12]。本试验采用75%乙醇灭菌30 s和2%次氯酸钠溶液灭菌14 min相结合的方法，污染率降为2.73%，出芽率为44.44%。次氯酸钠溶液灭菌时间再延长后，出芽率大幅度降低，可能对外植体产生毒害作用从而导致诱导率下降。灭菌后多次用灭菌水对外植体反复漂洗，可以减少残留次氯酸钠溶液对外植体的伤害。

MS是植物组织培养中最常用的基本培养基之一，玉簪的组织培养方法中最常用的即MS培养基，MS培养基中的大量元素和微量元素提供了植物生长所必需的无机盐，有机元素和蔗糖提供植物生长所需的碳源、氮源、矿质营养和维生素，对植物细胞和组织增殖和分化起促进作用。本试验以MS为基本培养基，可诱导、增殖并生根，形成完整植株。

激素在植物组织培养中起到至关重要的作用，在不同的步骤以基本培养基添加不同激素可达到培养目的。紫萼诱导过程中，添加6-BA 4 mg·L-1和NAA 0.2 mg·L-1可以达到较好的诱导效果，诱导率为46.3%，芽发育正常，没有畸形或玻璃化等现象，且能够在后期持续发育和分化。在获得健康的不定芽后，通过MS基本培养基添加6-BA 4 mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1和2,4-D 0.25 mg·L-1激素共同作用，可以达到较好的增殖效果，在该激素配比下，紫萼伸长率为3.5，增殖率为3.9，芽体保持正常发育，未出现畸形或玻璃化等现象，并在随后的1年多的继代周期保持高速的增殖效率，为较适合的增殖培养基。生根培养中，以1/2 MS为基本培养基添加ABT更有利于生根和植株生长，平均每株形成4～6根，根长2～9 cm，生根率可达到98.0%，是适合紫萼生根的培养基。

紫萼经过1个月的生根培养后形成完整植株，可以用于炼苗。在适合的温度和湿度条件下，基质采用园土、泥炭和珍珠岩混合，成活率在97%以上。园土黏重，添加泥炭后，增加土壤通气性，改善酸碱度，提高土壤肥力。添加珍珠岩可以增加土壤透气性，改善土壤保水能力和通气条件[13]，减少土壤板结，降低紫萼在生长过程中出现烂根现象。珍珠岩有利于移栽成活，但不利于后期叶片和根系生长，泥炭促进移栽成活和叶片生长，园土不利于初期生根和叶片生长，但有利于后期植物生长[14]。因此，采用3种基质的混合可促进移栽成活和后期生长。培养2个月后，可移栽至阴凉的地方露地栽培。在玉簪生长过程中可以施加叶面肥促进叶片生长，也可以在露地栽植前添加基肥，一般是腐熟有机肥6～7 kg·m-2。生长过程中以薄肥勤施、少量多次、营养齐全为原则[15]。