浙产三叶青地下地上部分抗氧化活性比较

张进军，张作法，吕国英，陆玫丹，方立林

(1.浙江武义汇美中药材有限公司，浙江 武义 321200； 2.浙江省农业科学院 园艺研究所，浙江 杭州 310021；3.武义县农业农村局，浙江 武义 321200； 4.武义县自然资源和规划局，浙江 武义 321200)

三叶青为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤，是我国特有的珍稀药用植物[1]。三叶青主要分布于我国浙江、福建、广西、云南等地，主要以地下块根入药，于2018年2月入选新“浙八味”中药材[2]。主要用于各种癌症、热症、炎症等治疗，已列入浙江省公费报销中药名录。前期研究发现， 三叶青具有抗肿瘤[3]、抗炎镇痛[4]、抗病毒[5]、护肝[6]、免疫调节[7]等广泛的药理活性。

相对于块根，三叶青地上部分极少得到合理利用，存在大量的资源浪费。近年来，研究者多集中于对三叶青块根组成成分和药效的研究[8-9]，鲜有对三叶青地上部分的研究。本文对三叶青地上地下部分提取物抗氧化活性进行比较，为其后续的开发和研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

三叶青地上、地下部分均采集于武义汇美中药材有限公司三叶青种植基地，经干燥后，过0.125 mm筛备用。

1.2 提取物的制备

取粉碎好的地下、地上部分各50 g，加入1 500 mL 70%乙醇，超声提取30 min，提取结束后，过滤，残渣再加入1 500 mL 70%乙醇超声提取1次，合并滤液，真空旋转蒸发浓缩，进一步冷冻干燥，得提取物。

1.3 活性成分含量测定

多酚含量。根据Singleton等[10]的方法略加改动。准确移取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL五倍子酸溶液于离心管中，用蒸馏水定容至1 mL，再加入0.5 mL的福林酚试剂，摇匀，反应8 min，再加入2 mL 10%碳酸钠溶液，摇匀，避光反应60 min，于750 nm处测定吸光度，以五倍子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。准确移取0.5 mL样品溶液，按上述方法在760 nm处测定吸光度，计算样品中多酚含量。

总黄酮含量。根据文献[11]，具体步骤：准确移取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL芦丁标准溶液于离心管中。用70%乙醇补足至1 mL。首先加入0.3 mL的5%亚硝酸钠溶液，摇匀，反应5 min；再加入0.3 mL的10%硝酸铝溶液，摇匀，反应5 min；最后加入1 M的氢氧化钠溶液4.0 mL，摇匀，反应10 min。在波长510 nm下测量吸光度，以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程。准确移取1 mL的样品溶液，按上述方法在510 nm处测量吸光度值，计算总黄酮的含量。

1.4 抗氧化活性分析

DPPH自由基清除能力[12]。取2 mL样品置于10 mL 离心管中，加入2 mL现配的0.1 mmol·L-1的DPPH甲醇溶液，混合均匀后，在室温下置于暗处静置30 min，于517 nm处测定吸光度。

还原能力测定[13]。在1 mL磷酸缓冲溶液(pH 6.6)中加入0.4 mL样品溶液，1 mL 1%铁氰化钾，混合物在50 ℃水浴保温20 min，急速冷却，加1 mL 10%三氯乙酸，5 000 r·min-1离心10 min。取上层清液2 mL，加0.2 mL 0.1% FeCl3，混合均匀，在波长700 nm下测吸光度。

ABTS清除能力[14]。称量0.031 8 g ABTS+用去离子水定容至10 mL，称取0.013 4 g过硫酸钾用去离子水定容至10 mL，将ABTS+和过硫酸钾溶液按照1∶1的比例混合后，避光保存12～16 h。用磷酸缓冲溶液稀释ABTS+储备液，使其在734 nm波长处测定的吸光度值为0.7±0.02。提取物溶液0.5 mL加入ABTS+测定液2.0 mL，准确振荡30 s，测在734 nm波长处的吸光度值。

羟基自由基清除能力[15]。1 mL样品加入1 mL 12 mmol·L-1FeSO4水溶液，再加入1 mL 12 mmol·L-1H2O2溶液，37 ℃下保温10 min，再加入1 mL 6 mmol·L-1水杨酸，37 ℃下保温30 min，然后10 000 rpm、4 ℃下离心10 min，取上清液在510 nm处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 总黄酮和多酚含量

三叶青地上、地下部经70%乙醇提取，干燥得率分别为18.40%和14.29%。图1显示，地上、地下部黄酮类含量分别达到12.69%和11.93%，多酚含量分别达到17.38%和16.94%。由此可知，三叶青地上部分总黄酮和多酚含量略高于地下部分提取物，两者间并无显著差异。

柱间无相同字母表示组间差异显著。图1 三叶青地上地下部分提取物中黄酮与多酚含量

2.2 DPPH自由基清除能力

由图2可知，三叶青地下和地上部分的提取物对DPPH自由基均有一定的清除能力，且清除能力随着浓度的增加而增强。地下块茎和地上藤叶对DPPH清除率达到50%时，所需要的效应浓度分别为0.190 2和0.139 5 mg·mL-1。地上部分提取物的DPPH清除活性略高于地下部分。

图2 地下、地上部分不同提取物浓度的DPPH自由基清除活性比较

2.3 总还原力

由图3可知，地上和地下部分提取物均具有一定的还原能力，吸光度的高低反映了提取物的还原能力。总还原力随溶剂提取物浓度的增加而增大，总还原力为0.092～1.899，各浓度不同提取物的还原力均低于阳性对照。在相同浓度下，地上部分提取物的还原力高于地下部分。

图3 地下、地上部不同提取物浓度的还原力比较

2.4 对ABTS自由基的清除作用

如图4所示，地上部分提取物的清除率显著高于地下部分提取物。在浓度低于0.75 mg·mL-1时，BHA对ABTS自由基的清除率明显高于地上、地下提取物。当质量浓度高于0.75 mg·mL-1时，地上部分提取物与BHA的清除效果持平。

图4 地下、地上部分不同提取物浓度的ABTS自由基清除活性比较

2.5 对羟基自由基的清除作用

如图5所示，不同浓度的三叶青地下、地上部分提取物和BHA均具有一定的羟基自由基清除能力。三叶青地下地上部分提取物对羟基自由基的清除作用显著低于BHA。在0.19～3.0 mg·mL-1，三叶青地下、地上部分提取物清除率分别为7.25%～58.30%和4.96%～68.70%。

图5 地下、地上部分不同提取物浓度的羟基自由基清除活性

3 小结

目前对三叶青的研究大多集中在抗炎和抗肿瘤方面，鲜有抗氧化活性的报道，特别是地上部分更是少有报道。提取物为混合物，成分复杂，难以用单一抗氧化指标评价，故采用4种抗氧化评价体系，尽可能全面、客观地评价不同提取物的抗氧化活性。本文对三叶青地下、地上部分提取物进行抗氧化活性比较，并对其多酚和黄酮含量进行测定。研究发现，地上部分提取物中黄酮和多酚含量略高于地下部分，但差异不显著。在ABTS、DPPH和还原力试验中，地上部分提取物的抗氧化活性显著高于地下部分提取物，而地下部分提取物的羟基自由基清除活性显著高于地上部分。以上差异可能是由于提取物中活性成分的作用机理不同导致。本试验中，三叶青地上部分比地下部分显示了较强的抗氧化活性，这对于进一步开发利用三叶青地上部分具有很重要的意义。