灵芝菌种液氮保藏工艺分析

谢航，林娟

(福州大学 生物科学与工程学院，福建 福州 350108)

灵芝是我国著名的食药用菌，在我国系统描述的种类有103个种[1]，其中灵芝(Ganodermalingzhi)原称为赤芝(Ganodermalucidum)是我国灵芝属的主要种类[2]，其干燥子实体被作为法定的中药材收录于《中华人民共和国药典》当中。目前有关灵芝类的研究已逐渐成为热点，然而多数的研究者专注于灵芝的分类鉴定[3-5]、药理作用[6-8]、有效物质[9-11]、基因组和基因功能[12-15]等，而忽视研究菌株的稳定性、基因完整性的安全长期保藏，一旦由于管理或保藏技术的原因，致使菌株丢失、变异、退化，将很难持续开展后期的研究，因此，菌种的保护工作显得尤为重要。

菌种保藏的方法很多，对于食药用菌，液氮保藏是一种公认的、长久有效的保藏方法[16-17]，然而陈燕妍在对担子菌菌种24属43种122株进行液氮保藏时发现，灵芝属的菌株有较明显的失活[18]，顾金刚也指出，菌种进行液氮保藏需要对其进行优化才能得到较好的保藏效果[16]。鉴于此，本文以灵芝菌种为材料，对影响液氮保藏效果的降温速率、保护剂浓度、解冻温度、培养基质和菌饼大小等方面进行系统研究，以期掌握灵芝菌种的液氮保藏技术，使之在灵芝种质资源的保藏中得到更好地应用。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

灵芝芝120由福建省食用菌种质资源保藏管理中心提供。

1.2 培养基

培养基1(PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

培养基2：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

培养基3：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，棉籽壳30 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

培养基4：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，木屑30 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

其中马铃薯、棉籽壳和木屑需要经过热沉提后过滤。

1.3 主要仪器

恒温培养箱(SHP-250型，上海精宏实验设备有限公司)，超净工作台(SW-CJ-2FD型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，手提式高压蒸汽灭菌锅(YXQ-LS18SI型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，Cryo GenesisTMV5程序降温仪(广州倍玛特仪器设备有限公司)，恒温水浴锅(HH-US-A，上海赫田科学仪器有限公司)，液氮罐(YDS-30，山东博科科学仪器有限公司)

1.4 实验方法

1.4.1 菌种培养与保藏管制作

灵芝芝120接种于PDA培养基，28 ℃下恒温培养，待菌丝覆盖至直径9 cm平皿的四分之三时，用6 mm打孔器均匀取菌饼，转移至冷冻管中，注入已灭菌的10%甘油，静置过夜。

1.4.2 降温程序设计

试验设9个降温处理和1个不经降温处理液氮保藏，程序降温在程序降温仪上进行，每个程序5个重复，同时采用30 ℃水浴解冻处理。

程序设计方案见表1，试验以灵芝菌种萌发时间、萌发率与萌发速度为指标，筛选出最优降温程序设计。

表1 液氮保藏降温处理

1.4.3 不同保藏培养基试验

灵芝芝120菌种分别用1.2中的4种培养基培养，待菌丝培养好，用6 mm打孔器取菌饼，每种培养基5个重复，采用最优降温程序处理。

1.4.4 不同菌饼大小试验

采用PDA培养基培养菌种，分别采用4 mm、6 mm和8 mm打孔器取菌饼，不同大小的菌饼各5个重复，采用最优降温程序处理。

1.4.5 不同甘油浓度试验

采用PDA培养基培养菌种，用6 mm打孔器取菌饼后，以甘油作为防冻剂，设置甘油与蒸溜水体积比为0%、5%、10%、15%和20% 5个梯度，分别注入到冷冻管中，每个甘油浓度5个重复，采用最优降温程序处理。

1.4.6 不同解冻温度试验

菌种在液氮罐内保藏2个月后，设置25、30、35和40 ℃恒温水浴解冻处理，每个解冻处理5个重复。

1.4.7 保藏效果评价方法

取出液氮保藏2个月后的灵芝菌种，经解冻后，接种于PDA培养基上，每个处理5个重复，28 ℃恒温培养，记录菌丝萌发时间，测量生长速度，观察菌落特征，分析其保藏效果。

2 结果与分析

2.1 不同降温处理对灵芝菌种保藏影响

灵芝芝120菌种经不同降温处理后，其萌发时间、萌发率和生长速度存在差异(表2)。芝120菌种经程序9和程序10处理后，萌发率分别为80%和60%，菌种出现死亡现象，其萌发时间滞后，并且生长速度较慢，表明芝120菌种经这2种程序处理后受到较严重的损伤。程序1～8处理灵芝菌种后，虽然菌种均能100%萌发，但萌发时间与生长速度的差异也较大，其中程序1、程序5和程序8处理的灵芝菌种萌发最快，为2 d，且生长速度也处于最快的梯队，超过0.7 cm·d-1。而程序2与程序7处理的灵芝菌种的萌发时间延长至5 d，生长速度也较慢，与经程序1、5、8处理后的生长效果相比达到极显著差异。

表2 降温处理对灵芝菌种液氮保藏的影响

根据程序1、5、8的特点，发现从4 ℃降至-40 ℃时，以每分钟1 ℃的速率进行降温，灵芝菌种的保藏效果优于程序2、6、7、9中采用的每分钟4 ℃或9 ℃。这表明灵芝菌种采用液氮保藏时，从4 ℃降至-40 ℃时的降温速度不宜太快。

2.2 不同培养基对灵芝菌种保藏影响

从表3可以看出，4种不同培养基培养的灵芝菌种，经液氮保藏后，在萌发时间和萌发率上并无差异，但生长速度存在显著差异。以培养基4培养的灵芝菌种，保藏后的灵芝菌种生长速度最快，其次是培养基3。这表明培养基对灵芝菌种的液氮保藏效果有影响。

表3 培养基对灵芝菌种液氮保藏影响

2.3 不同菌饼大小对灵芝菌种保藏影响

菌饼大小试验(表4)可以看出，灵芝菌种经适宜的程序降温处理后进行的液氮保藏，3种菌饼大小的灵芝菌种在萌发时间和萌发率无差异，但生长速度是随着菌饼增大而加快，这说明菌饼的大小将影响灵芝菌种保藏后的生长速度。

表4 菌饼大小对灵芝菌种液氮保藏影响

2.4 防冻剂浓度对灵芝菌种保藏影响

在低温冷冻保藏中，一般都需要添加防冻剂来提高菌种保藏的活力。从表5可看出，不加甘油作为防冻剂的灵芝菌种在液氮保藏后萌发率仅为60%，且所需的萌发时间最长。而不同浓度的甘油对灵芝菌种的液氮保藏效果在萌发率和生长速度上未体现显著差异；但从萌发所需时间看，以15%甘油为保护剂所需的萌发时间为1 d，而20%甘油的萌发时间延长至3 d。这表明灵芝菌种在液氮保藏时需要添加一定浓度的保护剂有助于提高其存活率，但添加浓度不宜过高。

表5 甘油浓度对灵芝菌种液氮保藏影响

2.5 不同解冻温度对灵芝菌种保藏影响

灵芝菌种经液氮保藏后，在4种不同温度下进行解冻复苏，均可以100%存活，萌发时间差异小，但是萌发后的生长速度存在显著差异(表6)。其中灵芝菌种经35 ℃解冻后的生长速度相对快，且菌丝浓密；而25 ℃和40 ℃解冻的菌种生长速度慢，生长的整齐性较差，表明灵芝菌种在25 ℃和40 ℃下解冻后的菌种活力受到影响。

表6 解冻温度对灵芝菌种液氮保藏影响

3 小结与讨论

在液氮保藏中涉及多种因素，因此，找到最优的工艺是进行液氮保藏的核心。以往降温处理过程中，真菌一般常用的程序是以每分钟1 ℃降温至-30～-40 ℃，然后迅速放入液氮中[16-18]。本文对灵芝菌种的降温程序进行优化时也发现，在4～-40 ℃时，以每分钟1 ℃速率进行降温，菌种的活力最高，但在常温降至4 ℃，却是以每分钟4 ℃或9 ℃的效果最好。而刘新锐等[19]在采用相同降温程序对香菇菌种进行液氮保藏时，复苏后的菌种生长速度无差异，这可能是不同种类食药用菌本身的特性差异引起的。

同时，保藏基质的选择是液氮保藏工作中的一个重要因素[17]。灵芝菌种在不同的培养基下，其生长状态表现出差异[20-21]，也影响灵芝菌种的液氮保藏效果。本文研究发现，在PDA培养基中添加木屑浸出液作为灵芝菌种保藏培养基，复苏后的菌种活力最好，而且保藏的菌饼直径越大，复苏后的活力也越高，这都可能与菌饼所含的营养物质有关。

保护剂是超低温菌种保藏中必须添加的，一般常用的有甘油和二甲亚砜。由于二甲亚砜在一些条件下会对真菌产生毒害，因此，在食药用菌中通常选择10%甘油作为保护剂[17]。本文研究发现，添加15%甘油的效果也很好，这与香菇保藏实验结论不一致。可能是由于甘油除了作为保护剂外，其本身也是碳水化合物[22]，灵芝菌种可利用其作为营养物质。所以即使甘油浓度达到20%时，影响萌发时间，但生长速度与添加10%和15%甘油的无差异。

灵芝虽然属于高温性菌类，但适宜的生长温度是28 ℃，温度过高将抑制其生长[23]。保藏后多数采用38～40 ℃进行快速解冻[17-18]，本文采用40 ℃快速解冻液氮保藏后的灵芝菌种，发现其复苏后的活力明显受到抑制，这表明即使是短时高温也对灵芝菌种的活力产生影响。因而灵芝菌种在液氮保藏后的解冻温度不宜超过35 ℃。

通过本文的研究，得到较优的灵芝菌种液氮保藏工艺为：采用每分钟4 ℃或9 ℃从室温降温至4 ℃，后以每分钟1 ℃降温至-40 ℃；采用添加木屑浸出液的PDA作为培养基；取菌饼8 mm大小；注入10%～15%甘油进行液氮保藏；在35 ℃水浴快速解冻。由于菌种保藏是一项长期工作，本文仅从成活率、萌发时间和菌丝生长速度对灵芝菌种的液氮保藏效果进行初步评价，还需经过更长保藏时间和其他性状的检测，这有待后续进一步研究。