短期低温胁迫对‘龙牧807’苜蓿幼苗生理代谢的影响

李 波， 李晨阳， 李 红， 杨 曌

(1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院， 抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室， 黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院， 黑龙江 齐齐哈尔161005)

低温冷害严重影响了牧草的生长发育，制约了牧草的种植地域分布，是影响牧草越冬的关键因素之一[1]。利用分子育种技术提高作物的抗低温能力是近年来的研究热点，但植物对低温的抗性是一个复杂的数量性状，单一的基因无法完全提高植物抗低温能力[2]。植物在逆境条件下产生复杂的生理生化响应来抵御低温胁迫[3]。我国北方地区冬季寒冷，年平均气温偏低，导致牧草在春末返青晚，影响牧草在秋季的利用价值，提高牧草的抗低温能力是解决牧草在我国北方地区利用价值是一大难题。

紫花苜蓿(MedicagoSativaL.)作为多年生草本植物，因其具有适应性广、产量高、抗寒、耐盐碱、固氮能力强等特点，在我国北方广泛种植，是全球范围内极具栽培价值的牧草之一[4]。近年来，紫花苜蓿抗寒能力的研究多集中在对低温胁迫下各生理指标变化及其抗寒能力综合评价。邓雪柯等人[5]对苜蓿在低温胁迫下的生理生化特性变化研究发现，在4℃处理下叶片的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性呈先升高后下降趋势，脯氨酸(Proline，Pro)含量随冷处理时间增加呈增加趋势，在高于—3℃低温胁迫时，叶片的电导率呈缓慢增加趋势，该紫花苜蓿可以耐受—3℃的低温；陶雅等人[6]通过对3个紫花苜蓿品种抗寒生理适应性研究发现，苜蓿根内可溶性糖(Soluble sugar，SS)、全氮、游离Pro和游离氨基酸含量会在秋冬季一直保持较高水平，春季返青时下降，苜蓿根内丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量在秋季升高，在晚秋随气温下降而降低，‘阿尔冈金’抗寒性最强，‘金皇后’次之，‘甘农3号’最差；秘一先等人[7]发现俄罗斯杂花苜蓿和3个紫花苜蓿抗寒品系温度阈值上限可溶性糖和可溶性蛋白为0℃，脯氨酸和丙二醛为4℃，SOD、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(Aseorbate peroxidase，APX)及谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPX) 活性低温处理下的变化差异不显著。关于苜蓿对低温胁迫的响应已被广泛关注，但在控制温度进程和全面分析低温对苜蓿的生理代谢作用方面仍有待完善。本研究对‘龙苜807’苜蓿幼苗短期低温胁迫的机理进行了初步的研究，筛选抗低温作用敏感指标，旨为苜蓿低温胁迫的生理响应奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用‘龙苜807’苜蓿种子(MedicagoSativa‘Longmu No.807’)由黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院提供，其籽粒千粒重为2.0 g，种子发芽率为98%。

1.2 幼苗的培养

2019年5月15日，使用育苗钵(高度 13 cm、下口径14 cm、上口径16 cm)对供试材料进行土培种植，培养基质为黑土∶针叶土=5∶1，均匀播入 30 粒种子后覆盖1 cm厚的培养基质，将地膜覆盖在营养钵上，保持种子萌发时需要的水分，待幼苗培养至三叶一心期后，每个营养钵中留 10 株幼苗，幼苗培养在25℃植物培养室内，期间每 2 d补水一次，待幼苗培养至45 d，高度长至 10～15 cm时即可用于低温胁迫处理。

1.3 低温胁迫处理

对培养45 d的幼苗进行间苗处理，每个营养钵中保留10株长势均匀的苜蓿幼苗，并进行低温胁迫处理，处理温度为0℃，—2℃，—3℃，—4℃和—5℃，每个温度处理2 h，共处理3批，取混合叶片，每个处理3次重复，以25℃未处理的幼苗为对照(CK)，采集各处理的苜蓿幼苗叶片，置于—80℃冰箱中备用。

1.4 苜蓿幼苗叶片各指标的测定方法

1.5 数据的处理与分析

采用SPSS 21.0统计学软件进行显著性分析、相关性分析和主成分分析。对测得数据用模糊数学隶属度公式进行转换，隶属函数公式为：U(Xij)=(Xij—Xmin)/(Xmax—Xmin)，反隶属度的计算：U′(Xij)=1— (Xij—Xmin)/(Xmax—Xmin)，公式中，U(Xij),U′(Xij) 为第i个胁迫浓度的j项指标的隶属度，Xmin,Xmax分别为j项指标的最小值和最大值。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对苜蓿幼苗叶片渗透调节物质的影响

SS，SP和Pro具有调节植物的渗透平衡的作用，植物通过增加渗透调节物质积累从而缓解逆境胁迫对植物的伤害。随着温度的降低，SS，SP和Pro含量呈先升高后降低的变化趋势，3种渗透调节物质在-3℃均达到最大值(图1a,b,c)，说明苜蓿幼苗可通过积累渗透调节物质应对低温的伤害。在0℃，-2℃，-3℃，-4℃和-5℃低温胁迫下，SS含量分别较CK增加了53.37%，63.41%，91.94%，21.14%和9.51%；Pro含量分别较CK增加了121.19%，157.99%，227.16%，118.97%和92.96%；SP含量分别较CK增加了141.13%，150.90%，188.35%，146.19%和114.53%，方差分析显示，除—5℃处理组SS外，低温胁迫组的SS，SP和Pro含量与CK比较均差异显著(P<0.05)。

2.2 低温胁迫对苜蓿幼苗叶片膜透性的影响

MDA和RC是衡量膜损伤程度的重要指标。随着温度的降低，叶片中MDA含量和RC呈逐渐升高的变化趋势，在—5℃处理组达到最大值(图2a,b)，表明随着温度的降低膜损伤程度也随之增加。在0，-2℃，-3℃，-4℃和-5℃低温胁迫下，MDA含量分别较CK增加了27.59%，47.00%，68.70%，76.50%和109.28%；RC分别较CK增加了67.30%，69.26%，71.96%，85.44%和90.63%(P<0.05)。

图1 低温胁迫下苜蓿叶片渗透调节物质含量的变化Fig.1 Changes of osmoregulatory substance content in alfalfa leaves under low temperature stress注：不同小写字母表示在0.05水平上差异显著，下同Note:Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

图2 低温胁迫下苜蓿叶片膜透性的变化Fig.2 Changes of membrane permeability of alfalfa under low temperature stress

2.3 低温胁迫对苜蓿幼苗叶片活性氧积累的影响

图3 低温胁迫下苜蓿幼苗叶片膜氧化物质的变化Fig.3 Changes of membrane oxides of alfalfa under low temperature stress

2.4 低温胁迫对苜蓿幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

植物细胞中清除活性氧的抗氧化酶系统的活性增加可减轻逆境中对植物细胞的伤害。随着温度的降低，POD和SOD呈先升高后降低的变化趋势，在—3℃处理组达最大值，CAT和APX活性呈逐渐上升的变化趋势，在—5℃处理组达最大值(图4)，说明低温胁迫处理对4种保护酶产生不同的影响。在0℃，-2℃，-3℃，-4℃和-5℃低温胁迫下，POD活性分别比CK增加了88.65%，105.41%，184.86%，143.78%和66.22%；SOD活性分别较CK增加了88.50%，89.30%，102.94%，89.30%和75.94%；CAT活性分别比对照组增加了132.67%，170.30%，241.58%，272.28%和329.70%；APX活性分别较CK增加了58.00%，146.67%，148.00%，197.33%和264.00%(P< 0.05)。

图4 低温胁迫下苜蓿幼苗叶片抗氧化酶活性的变化Fig.4 Changes of antioxidant enzyme activities in alfalfa leaves under low temperature stress

2.5 低温胁迫对苜蓿幼苗叶片代谢物质含量的影响

随着温度的降低，GSH含量和PAL活性呈逐渐上升的变化趋势，在-5℃处理组GSH含量和PAL活性达到最大值(图5c,d)，可见低温胁迫影响了植物组织中木质素等和抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程。在0℃，-2℃，-3℃，-4℃和-5℃低温胁迫下，低温处理组的GSH含量分别比CK增加了84.74%，111.21%，114.52%，124.45%和181.99%；PAL活性分别比CK增加了 65.86%，79.77%，85.31%，93.63%和106.71%(P< 0.05)。

图5 低温胁迫下苜蓿幼苗叶片代谢物质含量的变化Fig.5 Changes of metabolite content in alfalfa leaves under low temperature stress

2.6 低温胁迫下各生理生化指标主成分分析

主成分的特征值和贡献率是选择主成分的重要依据，由表1可知，在测定的16个生理生化指标中，前2个主成分反映了总信息量的96.353%，特征值总和达到15.416，表明这两个主成分基本上能反映苜蓿抗寒能力。

表2 各指标主成分分析矩阵和特征向量Table 2 Principal component analysis matrix and eigenvector of indicators

2.7 低温胁迫下各生理生化指标隶属函数分析

选择主成分1中PAL，GSH，CAT和RC和主成分2中SS，Pro，SP和POD，应用隶属函数对不同低温胁迫下‘龙牧807’苜蓿幼苗叶片这8项生理生化指标进行综合分析。由表3可知，隶属函数值最大的是-3℃处理组，隶属函数值最小的是-5℃处理组。隶属函数综合评价值越大，表明苜蓿幼苗对渗透调节物质积累越多、抗氧化酶活性越高及对膜损伤越小。依据低温胁迫下‘龙牧807’苜蓿幼苗叶片生理生化的变化可知，该苜蓿能够耐受的最低温度为-3℃。

表3 低温胁迫下各指标隶属函数值Table 3 Values of membership function of each index under low temperature stress

3 讨论

SS，SP和Pro是重要的渗透调节物质，与植物的耐寒性密切相关[10]。大量研究表明，低温胁迫下，编码Hsp家族热激蛋白的基因能够诱导可溶性蛋白的变化，参与植物响应低温胁迫的代谢过程[11]。SS等糖类物质可为物质的生物合成提供能量，而Pro积累会降低细胞渗透势，保护细胞结构[12]。本研究中，温度的降低，SP含量的增加会促进下游物质的合成及碳水化合物的代谢平衡，SS和Pro也能够迅速对外界环境作出冷应激反应带来的损伤，这与李文馨等[13]人研究低温胁迫下鹿蹄草(Pyrola.callianthaH.Andres)生理响中Pro，SP和SS含量随胁迫时间增加呈现出明显的相关性的变化结果一致。

当逆境胁迫加重时，如果光合碳同化被阻断，多余的激发能量将被转移到氧气中产生活性氧(ROS)。ROS的积累会使细胞膜系统的膜脂受到过氧化损伤，最终使膜透性和离子透性增加，大量积累的ROS，加重膜质过氧化导致MDA大量积累[14]。本研究中，随着低温胁迫程度的加重，RC和MDA含量逐渐升高，表明温度越低，膜损伤程度越重，研究结果与邓仁菊等人[15]研究低温胁迫下火龙果的半致死温度和抗寒性分析及张艳侠等[16]人研究5个石榴品种的抗寒性评价的研究结果一致。

植物在抵抗逆境胁迫中，GLO作为光呼吸代谢的关键酶参与调控光合作用，而低温可破坏叶绿体的结构从而促进Chl降解，叶绿体内ROS增加了对光合结构产生破坏作用[21]。研究发现，随着温度的降低，导致苜蓿叶片Chl降解和GLO活性降低，说明低温可以影响苜蓿叶片的光合作用，还可使苜蓿叶片的GLO活性降低，导致光呼吸速率下降，不同温度处理表现为温度越低，对光合作用和光呼吸代谢胁迫能力越强。研究结果与山溪等人[22]和隽加香等人[23]对低温胁迫下结球甘蓝和番茄的光合色素和呼吸代谢的变化一致。

4 结论

随着低温胁迫强度的增加，‘龙牧807’苜蓿幼苗叶片中渗透调节物质、抗氧化酶活性、膜质透性、膜氧化物质和代谢物质发生不同的变化，SS，SP，Pro，RC，POD，CAT，GSH和PAL有较大载荷值的8项指标隶属函数分析表明，‘龙牧807’苜蓿苗期能耐受最低温度为—3℃。